이 프로토콜은 종자 표면 살균을 향상, 모델 종 애비도프시탈리아나의 기능 적유학의 기본 단계. 이 기술의 주요 장점은 하루 수백 개의 샘플을 처리 할 수 있도록 쉽고 높은 처리량입니다. 몇 가지 간단한 수정을 통해 이 방법은 다른 많은 모델 및 비모델 식물 종에 적용할 수 있습니다.
처음 이용자의 경우, 종자 생존에 모두 중요하기 때문에 매체의 온도와 원심분리 속도에 주의를 기울이십시오. 시작하려면, 증류수에 95%의 기술 에탄올을 추가하고 철저히 혼합하여 70%에탄올을 준비하십시오. 다음으로, 멸균 증류수 95밀리리터에 가정용 표백제 5밀리리터를 추가하여 5% 표백제 용액을 준비합니다.
그런 다음, 표백제 용액에 몇 방울의 니오니언 세제를 넣고 철저히 섞습니다. 다음으로, 비타민을 포함한 MS 중간 분말 2.2그램과 증류수 800밀리리터에 자당 10그램을 첨가하여 반강도 무라시게와 스쿠오그 배지를 준비합니다. 수산화 물화 칼륨 1개를 사용하여 매체의 pH를 5.7로 조정한 다음 증류수를 사용하여 최대 1리터까지 부피를 가져옵니다.
Aliquot 500 밀리리터 의 배지 를 1 리터 병에 넣고 4 그램의 천을 추가하여 단단한 매체를 준비합니다. 오토클레이브 후, 매체가 수조에서 섭씨 50~53도까지 식힙니다. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에 페트리 접시에 붓습니다.
선택적 매체를 준비하려면, 카나마이신을 매체에 넣고, 앞에서 설명한 대로 페트리 접시에 붓습니다. 흡혈구를 설정하려면 진공 펌프 입구를 적절한 크기의 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 그런 다음 튜브의 다른 쪽 끝을 디펜션 병의 양방향 뚜껑의 출구에 연결합니다.
튜브의 접합을 밀봉 필름으로 단단히 감싸서 밀폐 된 연결을 보장합니다. 다음으로, 두 번째 폴리에틸렌 튜브를 디펜션 병의 나사 캡 입구에 연결합니다. 그런 다음 튜브의 반대편을 얇은 폴리에틸렌 튜브가 장착된 수족관 밸브의 출구에 연결합니다.
필요한 경우 접합을 밀봉 필름과 싸서 공기 누출을 제거합니다. 48 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브의 두 배치를 점진적 인 숫자로 표시 한 후, 튜브의 원추형 끝의 바닥보다 약 1 ~ 2 밀리미터 높은 96 멸균 미세 원심 분리 튜브각각에 100 ~ 200 개의 아라비도시스 씨앗을 추가하십시오. 다음으로, 10 밀리리터 멸균 세알리테스 파이펫을 사용하여 각 튜브에 70%에탄올의 약 1밀리리터를 추가하고 뚜껑을 조심스럽게 닫습니다.
쉐이커에서 3분 동안 8헤르츠의 진동 주파수에서 튜브를 흔들어 주세요. 그런 다음 셰이커에서 어댑터를 제거하고 펄스 기능을 사용하여 씨앗을 회전하기 위해 벤치탑 미세 원심 분리기바구니로 옮겨넣습니다. 튜브를 랙으로 옮은 후 라미나르 플로우 후드 아래에 있는 모든 튜브를 엽니다.
오염을 피하기 위해 튜브에 장착 된 뚜껑의 부분을 만지지 마십시오. 그런 다음 라미나르 플로우 후드 아래에 멸균 200 마이크로리터 옐로우 팁에 수제 흡기의 수족관 밸브 입구에 넣고 펌프를 켭춥시다. 액체를 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗의 수준 바로 위에 팁을 삽입합니다.
다음으로, 10 밀리리터 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 튜브에 5%의 표백제 용액을 1밀리리터를 알리쿼트합니다. 튜브를 셰이커 어댑터에 다시 넣기 전에 뚜껑을 닫은 다음 이전에 설명한 대로 튜브를 흔들어 줍니다. 벤치탑 원심분리기의 펄스 기능을 사용하여 씨앗을 회전한 후, 새로운 멸균 200 마이크로리터 옐로우 팁에 수족관 밸브에 넣고 펌프를 켭분드합니다.
표백제 용액을 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗 의 수준 위에 팁을 삽입합니다. 다음으로, 10 밀리리터 멸균 세로지컬 파이펫을 사용하여 각 튜브에 멸균 된 물의 1 밀리리터를 알리쿼트합니다. 새로운 멸균 200 마이크로 리터 노란색 팁을 수족관 밸브에 장착 한 후 펌프를 켭채를 켭타보시면 됩니다.
물을 빨아 먹을 때 씨앗을 만지지 않도록 씨앗의 수준 바로 위에 팁을 삽입합니다. 마지막으로, 각 튜브에 멸균 된 물의 500 마이크로 리터를 알리 쿼트하고 라미나르 흐름 후드의 모든 뚜껑을 닫습니다. 씨앗은 이제 파종 될 준비가되어 있습니다.
필요한 경우, 튜브를 실온에서 최대 몇 시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도까지 유지하십시오. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 300~400마이크로리터의 멸균물을 페트리 접시에 옮겨 씨앗을 옮킨다. 10개의 튜브를 옮긴 후, 각 플레이트에 항생제 없이 녹은 반강도 무라시게와 스쿠그 배지의 1.5~2밀리리터를 붓습니다.
접시를 빠르게 소용돌이쳐 씨앗을 분배하고, 접시를 반대편에 테이프로 고정시십시오. 접시를 플라스틱 또는 알루미늄 호일에 싸서 3일 동안 냉장고에 넣고 균일한 발아를 얻습니다. 발아 분석은 2일, 3일, 4일, 7일에 수행된 70%에탄올을 사용하여 살균 시간의 10~40분 사이에 큰 차이를 나타내지 않았습니다.
그러나 살균 시간이 40분을 초과했을 때 발아율은 감소했습니다. 이에 따라 그린 코틸레던 출현률도 감소했다. 연구에 기초하여, 70%에탄올을 위한 3분 및 5%표백제3분은 씨앗을 살균하는 최소 시간으로 선택되었다.
원래 사용된 씨앗이 미생물로 오염되었다는 것을 보여주기 위해 비멸 성 씨앗은 접시에 직접 파종되었습니다. 멸균 씨앗에 비해, 비 멸균 씨앗은 7 일 발아 후 접시 전체에 확산 이틀 후 곰팡이 모양을 보였다. 서로 다른 종자 샘플을 처리하기 위해 단일 멸균 파이펫 팁을 사용하여 수행된 교차 오염 분석은 콜롬비아-0 유전자형 씨앗에서 카나마이신이 있는 판에 파종된 녹색 코틸레톤이 관찰되지 않은 것으로 나타났다.
이와 동시에, 컬럼비아-0 씨앗은 카나마이신이 없는 접시에 파종되어 발아 후 모든 코틸레톤이 녹색으로 나타났습니다. 이러한 결과는 단일 파이펫 팁을 사용하여 멸균 용액을 제거했음에도 불구하고 샘플 간의 오염이 이월되지 않는다는 것을 나타냅니다. 이 절차는 유전자 과발현, 게놈 편집, 세포외 국소화, 프로모터 활동 및 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용과 같은 많은 다른 기능성 유전체학 방법의 기초입니다.
