우리가 기꺼이 그녀의 지원에 대 한 3d 인쇄, 금형 디자인, 그들의 입력에 대 한 아만다 조이 Reidinger, 박사, 크리스 Nycz, 그리고 카 렌 레 마인 박사 에리카 스 털 츠 (학술 연구 및 응용 과학자, WPI 정보 기술 서비스)을 인정 캐시 Suqui와 제니퍼만 금형 디자인을 테스트 하는 그들의 도움에 대 한 촬영과 그의 도움에 대 한 마이클 오키프.  이 작품은 NSF IGERT 당선 1144804 (MWR, 있다), NIH R15 HL097332에 의해 지원 되었다 (MWR, TAH), NSF 소장 EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, 있다)와 NIH R15 HL137197 (MWR, 있다).
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1. 3D 인쇄 형 준비 하기
<ol><li>CAD 드로잉의 원하는 크기에 형을 준비 합니다.</li>
	<li>고해상도 3D 프린터에 CAD 파일을 보냅니다. 광택 마무리, 적절 한 플라스틱 인쇄 자료를 선택 합니다.</li>
	<li>인쇄 후 철저 하 게 세제와 물으로 금형 세척.</li>
</ol>2. 주조 PDMS 제외
<ol><li>균형에 기본 PDMS의 원하는 금액을 측정 합니다. 60 m m 금형에 대 한 직경 및 2mm 잘 게시물, 25 g를 사용 하 여.</li>
	<li>1:10 (w/w)에 경화제를 추가 PDMS 베이스에 비율.</li>
	<li>적극적으로 두 개의 구성 요소는 철저 하 게 결합 될 때까지 저 어. 부족 한 혼합 "저속" 표면 결과 PDMS의 불완전 한 치료 될 수 있습니다.</li>
	<li>3D 인쇄 금형, 인쇄 된 우물 위에 PDMS 기본 층의 형성을 활성화의 테두리 실험실 테이프의 조각을 넣으십시오.</li>
	<li>PDMS 혼합물을 금형에 부 어 고 형 될 때까지 모든 거품은 탈 가스 진공 챔버 합니다.</li>
	<li>제거 하려면 2-4 h, 또는 충분히 경화 될 때까지 50 ° C에서 PDMS를 치료.</li>
	<li>랩 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 추출 PDMS 부정.</li>
	<li>금형은 완전히 치료 되도록 (3D 인쇄 형에서 제거) 후 추가 1 시간에 대 한 60 ° C에서 PDMS를 품 어.</li>
	<li>어떤 잔류물을 제거 하는 세제와 물으로 깨끗이 PDMS를 씻어. 부족 한 세척 PDMS 네거티브의 첫 번째 사용에 대 한 불 쌍 한 링 형성 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 조작 Agarose 웰 스
<ol><li>Agarose 웰 스 셀을 뿌리기 전에 1 일 준비.</li>
	<li>DMEM과 압력솥 2% (w/v) agarose 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>피펫으로 4 mL 압력가 PDMS 부정적으로 녹은 agarose. 다음 피펫으로 agarose 직접 PDMS의 게시물에 음화. 거품 잘 차원에서 이질성을 발생할 수 있습니다 피펫으로 팁 모든 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>참고: 금형; 연극 하지 마십시오 agarose의 위쪽 표면 agarose 우물 PDMS에서 제거와 6-잘 문화 접시에 배치 수준 수 있도록 평면, 해야 합니다. 남은 agarose 있을 수 있습니다 다시 압력가 사용 다시, 하지만 한 번 이상 하지.</li>
	<li>agarose 냉각 후 (약 10 분 4 mL agarose;에 대 한 큰 형 이상 냉각 시간을 할 수 있습니다), 신중 하 게 무딘 집게를 사용 하 여 PDMS 원판에서 agarose 웰 스를 분리 하 고 6-잘 접시의 우물으로 전송.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 agarose 우물 잠수함 그리고 하룻밤 사용 하기 37 ° C 배양 기 전에 equilibrate.</li>
</ol>4. 시드 조직 반지
<ol><li>문화 쥐 대동맥 평활 근 세포21 (RaSMCs) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 포함 된 DMEM L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 나트륨 pyruvate, 및 1% 페니실린-스 70% 합류를 도달할 때까지. 참고: 셀 5% CO2 와 15 cm 조직 배양 배지에서 37 ° C 배양 되어야 한다.</li>
	<li>금형 equilibrated 후 (3 절), 시드를 위한 RaSMCs를 준비.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 접시 당 5 mL로 두 번 접시를 헹 구 십시오.</li>
	<li>15 cm 배양 접시 당 3 mL 0.25 %trypsin 추가 합니다. 2-3 분, 또는 때까지 세포가 접시를 낸 37 ° C 배양 기에 격판덮개를 이동 합니다.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 동일한 볼륨 (접시 당 3 mL) 트립 신을 무력화. 철저 하 게 덩어리 헤어 셀 resuspend</li>
	<li>세포 현 탁 액 trypan blue 염료와 1: 1의 약 수를 희석 하 고는 hemocytometer와 셀.</li>
	<li>세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 200 x g에 5 분의 총 볼륨 원심</li>
	<li>ML; 당 10 백만 셀의 농도에서 세포 resuspend 50 µ L 당 500, 000 셀이 됩니다. 참고: 다른 세포 유형을 다른 세포 농도 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose 금형에서 모든 중간 발음 개별 우물에서 모든 매체를 제거 하지만 하지 우물의 바닥 찌를 다는 것을 조심 하십시오.</li>
	<li>피펫으로 50 µ L의 각 음에 서 스 펜 션.</li>
	<li>조심 스럽게 agarose 몰드의 외부 신선한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 하도록 하지 중간 오버플로 agarose의 우물에 주의 해야 합니다. (약 16 h) 하룻밤 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>하룻밤 부 화 후 금형, 외부에서 매체를 발음 하 고 금형과 반지 완전히 빠져들 수 있도록 6 잘 플레이트의 각 음에 4.5 mL 신선한 매체를 추가 합니다. 매일 변경 매체입니다.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 3D 인쇄를 사용 하 여 쉽게 사용자 정의 크기와 자기 조립된 조직 링의 빠른 제작을 위해 다양 한 방법 제시는. 우리의 방법은 비슷합니다 Svoronos 외에 보고. 6 , 벌집 3D 인쇄와 개 뼈 모양의 왁 스 금형 PDMS 원판을 사용 했다. 그러나, 금형 몇 가지 독특한 디자인 기능을 포함 하도록 수정 되었습니다. 노치 (그림 4A(1)) 표시를 개별적으로 모니터링 각 링 수 있도록 금형의 방향을 제공 합니다. 중앙 홀 (그림 4A(2)) 우물에 매체의 확산을 향상 시킬 수 있습니다. CAD 파일 번호 형;에 직접 인쇄 따라서, PDMS 제외 각 버전 번호 표시 됩니다 하 고 직경 (그림 4A3) 게시. 테이퍼 외부 벽 (그림 3(1), 5 °), 잘 골짜기 (그림 3(2), 45 °), 그리고 중앙 구멍 (그림 3(3), 5 °)의 상단에 쉽게 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제외를 제거 하려면 agarose 우물이 쉽게 PDMS 원판에서 제거 하 고 (그림 4A(2), A(4)).
우리는 다양 한 직경 및 기본 인간의 부드러운 근육 세포 (SMCs)18,22, 쥐 대동맥 SMCs7 을 포함 한 세포 종류의 자기 조립된 고리 모양의 조직 조작 하 여이 시스템의 다양성을 증명 하고있다 , 23, 인간 간 엽 줄기 세포 (hMSCs)13, 그리고 SMCs 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)11 (표 1)에서 파생 된. 진행 중인 작업에서 우리는 반지 추가 셀 유형 내 피 세포에서에서 형성 평가 하 고 tracheal 교체에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 다양 한 크기의 연골 고리 융합. 완전히 세포 유래 구조 뿐만 아니라 우리는 또한 사용이 시스템 통합된 복사해올된 젤라틴 스피어13,22와 반지를 조작 하. 스피어 자기 집합 추가 기계적 강도 제공 하기 위해 동안 조직 고리 내에서 통합 될 수 있다 또는 지역화 성장 요인13,22의 배달.
조직 링을 조작 하는 경우 휴대폰 번호의 최적화 다른 세포 유형에 대 한 필요할 수 있습니다. 숫자 다를 수 있습니다 최소 셀 크기와 세포의 종류에 따라. 예를 들어 Ipsc에서 파생 된 hSMCs 600000 셀/링11에 씨를 뿌리고, hMSCs 및 기본 hSMCs 400000 셀/반지13,22, 그리고 쥐 대동맥 SMCs는 500, 000 셀/반지18시드 시드. 물마루 차원 반지 형성 및 셀 링 형성24에 필요한 최소 수 영향을 또한 수 있습니다. 인간의 세포와 3D 인쇄 형 연구, 대 한 여 물통 폭 2 m m의 사용 되었다. 원래 폴 리 카보 네이트 형 750000 hSMCs 2mm 셀 링18를 형성 하는 데 필요한 3.75 m m의 구 유 폭을 했다. 감소 물 폭 46%, 반지25당 400000 셀 링 형성에 필요한 셀의 수를 줄일 수 있었습니다. 셀 링 당 시드의 표 1에 요약 되어 있습니다.
3D 인쇄 소재를 선택할 때 많은 요인 고려 될 필요가 있다. PDMS은 60 ° C에 일반적으로 치료 된다, 때문에 3D 인쇄 자료 충분히 높은 있어야 PDMS 경화 하는 동안 손상을 방지 하려면 온도 용융. 이 연구에 사용 되는 재료의 용융 온도 (독점 소재, 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다. 그러나, 1 시간에 60 ° C에서 구운 우리는 자료는 냄새를 생산 하기 시작 했다 관찰 했다. 따라서, 우리가 하기로 낮은 경화 온도 50 ° C를 위해 3D 인쇄 자료 손상 없이 PDMS를 구워 경화 시간을 증가. 경화 시간 조정 형태 큰 PDMS 네거티브에 금형 수정 하는 경우 필요할 수 있습니다. 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제거 후 60 ° C에서 추가 치료 기간에 노출 되는 3D 인쇄 형 온도 제한 하는 동안 볼품 없는, 나머지에서 부정적인 최종 PDMS를 방지 합니다. 참고 일부 자료 치료 PDMS의 억제, 그래서 선택한 소재 PDMS와 호환 되는지 확인 하십시오. 마지막으로, 금형 소재 독성 또한 고려 되어야 한다. 3D 인쇄 형 세포와 직접 접촉에서 되지 것입니다, 하는 동안 금형에서 일부 잔류물 PDMS 부정적인 치료 절차 동안에 전송 될 수 있습니다 가능 하다. 우리는 매우 철저 한 세척 세제로 부정적인 PDMS에서 어떤 잔류물을 제거 하는 충분 한 발견. 그러나, 우리는 이전 부적절 한 세척 agarose 웰 스 처음에 가난한 반지 형성에 부정적인 PDMS의 몇 가지 사용 지도 관찰. 다른 3D 인쇄 자료에서 PDMS 캐스트를 사용 하 여 세제 포함 하 여 모든 잠재적인 leachates 형 잔류물 제거 충분 한지 확인 하기 위해 추가 조사를 요구할 수 있습니다. 정기적인 테스트 시간이 지남에, 금형을 손상 하 고 반복된 사용 후 잔류물에 있는 증가 일으킬 수 있습니다 난방 사이클 (50 ° C)에 반복 가능한 그것으로 필요할 수도 있습니다. 날짜 하려면, 조직 반지를 성공적으로 생성 하는 데 사용 된 30 개 이상의 PDMS 원판을 생산 하는 단일 3D 인쇄 형을 사용 했습니다.
전반적으로, 3D 인쇄 폴 리 카보 네이트의 가공 보다 agarose 금형의 제작에 대 한 더 큰 다양성을 허용 한다. 그것은 가능 툴, 보다 높은 해상도 제공 하 고 금형 설계 도구를 사용할 수의 크기에 의해 제한 되지 않는다. 큰 사용자 지정 가능 하 고 그 끝이 등 기능 추가 가공 가능 하지 않을 수 있습니다. 이 시스템은 반지6,17이외에 다른 모양 뿐만 아니라, 자기 조립된 조직 조작에 적용할 수 있습니다. 반지 제조 방법을 사용 하 여, 조직 반지 세포 유형 및 tracheal 조직 공학13, 조작된 혈관7, 그리고 모델링 혈관 질환11에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 크기의 다양 한 개발 했습니다.

세포질 자기 집합 조작 설계 조직 혈관에 접근은 비 계 기반 접근 대신. 자기 조립, 비 계 없는 조직 큰 세포 밀도, 향상 된 매트릭스 증 착 및 강도, 그리고 비 계 기반 조직1,2,3,4에 비해 향상 된 생물 학적 기능을 할 수 있습니다. . 그러나, 특정 크기 및 모양 세 비 계 지원의 사용 없이 3D 조직 형성 도전 남아 있습니다. 이 프로세스는 시간과 노동 집약적인5될 수 있지만 몇 가지 방법을 함께 두꺼운 구조를 셀 시트의 레이어 퓨즈. 또는 셀 비 접착제 금형에 시드 수 하 고 허용 spheroids, 반지, 그리고 다른 조직 모양6,,78으로 집계 하.
자기 집합된 조직 반지 필요 적은 셀, 문화 시간을 단축, 그리고 관 보다 더 큰 적은 약 설계 조직, 하지만 여전히 기계적 테스트, 조직학, 검사 하거나 수 수축 및 다른 기능 테스트7 사용 , 9 , 10 , 11. 조직 반지 문화 매개 변수 수가 많은 검사에 이상적입니다 그리고 질병 모델11 로 사용을 위한 잠재력 또는 약12상영을 위한 도구가 그들은 빠르게 조작 및 쉽게 테스트할 수, 때문에. 또한, 반지 혈관 등 기관7,13, 더 복잡 한 조직 구조에 융합 될 수 있다 그리고 반지 spheroids,1415등 다른 모양 보다는 더 완전 하 게 융합 될 수 있습니다.
Agarose는 생체 적합성, 침투성, 및 비 세포 접착 속성 자체 조립된 조직 날조를 위한 금형 소재로 널리 이용 된다. 예를 들어, Norotte 그 외 여러분 agarose 금형 금형 모양 및 필요한 전문된 장비15제한 제어 사용 압출된 봉에서 조작. 황갈색 외 다양 한 모양 (피라미드, 광장)16사용자 지정 히드로 금형을 조작 하는 단위 건축 alginate 방울 입금. 그러나, alginate spheroids (300 μ m)의 큰 직경 낮은 해상도 기능 귀착되는. 낮은 해상도 셀 집계 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 고르지 못한 몰드 표면에 발생할 수 있습니다. 또는, agarose 매끄러운 기능 및 특정 크기6,,717비 접착제 금형을 만드는 폴리머 원판으로 캐스팅 될 수 있습니다.
우리는 이전 사용자 지정 환상 agarose 셀 시드 웰 스 가공 된 폴 리카 보 네이트 몰드7,18에서 PDMS 부정적인 캐스트에서 날조를 위한 시스템을 보고 했다. Agarose는 PDMS 부정으로 부 고7,18설정할 수 있습니다. 셀은 다음 시드 agarose 웰 스, 어디 그들은 자기 조립 하는 형태로 집계에 24 h7,18미만에서 비 계 없는 조직 반지. PDMS 원판 멸, 여러 번 다시 사용할 수 있으며 부드럽고 유연 하 고, 쉽게 응고 agarose 웰 스를 제거 하는. 때이 시스템 처음에 알려졌다 Gwyther 외. 7, PDMS 원판에서 캐스팅 됐다 가공 된 폴 리 카보 네이트 형 (그림 1A). Agarose 주조, 후 셀 시드 웰 스 개별적으로 잘라 되었고 12-잘 접시7,18의 우물에 배치. 단일 agarose 몰드 5 고리를 생성 하 고 개별 웰 스를 잘라 필요가 없습니다 및 PDMS와 각 반지 (그림 1B)를 생산 하는 데 필요한 agarose의 양을 줄이는 6 잘 플레이트의 잘에서 맞는 그런 디자인 더 최근에 바뀌었습니다. 작은 셀 구 유 폭 시드 고리 형성을 달성 하는 데 필요한 시드 셀의 수를 줄이기 위해 사용 되었다. 이러한 변화에도 불구 하 고 해상도 금형의 사용자 지정에 사용할 수 있는 표준 엔드밀, 제한 했다 그리고 micromilling는 엄청나게 비쌀 수 있다. 또한, 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 가공 하는 시간이 소요 될 수 있습니다 및 성가신에 시간을 예약 하는 필요 때문에 무 겁 게 사용자 지정 장비, 컴퓨터 지원 설계 (변환 하는 추가 컴퓨터 지원 제조 (CAM) 소프트웨어 활용 프로그래밍 도구 경로 및 가공 중 폴 리카 보 네이트 부품의 안정적인 없애거나 CAD) 파일입니다.
현재 연구에서 우리는 CNC 가공 하는 대신 3D 인쇄를 사용 하 여를 검사합니다. 3D 인쇄 엔지니어링 사용자 지정 임 플 란 트, 비 계 자료를 날조 한 세포와 조직 spheroids15,,1920의 직접 인쇄에 널리 사용 됩니다. 고해상도 3D 프린터를 사용 하는 우리 고 전문된 3D 인쇄 소재는 매끄러운을 가진 엄밀한 형 인쇄 수, 광택 표면 마무리 ( 재료의 표참조). 우리의 기술 주조 PDMS 네거티브와 agarose 우물에 사용할 수 있는 고도로 사용자 정의 고해상도 플라스틱 금형의 제작에 대 한 수 있습니다. 디자인 반복 그림 1에서 요약 된다. 금형 설계 추가 3D 인쇄 형에서 모두 PDMS 원판 및 PDMS 원판에서 agarose 웰 스의 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼 외부 벽과 중앙 구멍을 포함 하도록 3D 인쇄 형 버전에서 수정 되었습니다. 이 테이퍼 기능 표준 프로세스 가공으로 얻을 수 없다. 금형의 하단에는 우물의 바닥에서 거리는 두꺼운 agarose 게시물 agarose 잘 제거 하는 동안 침입의 위험을 줄이기 위해 게시물 아래의 기본 인이 반복에서 증가 되었다. 형과 링 제조 절차 개요로 그림 2에 표시 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

엔지니어링된 조직 조직 수리 및 교체, 임상적으로 사용 되 고 마약 검사 및 인간 질병 모델링 도구도 개발 되 고 있다. 자기 집합된 조직 향상 된 매트릭스 증 착, 강도, 기능 등 비 계 기반 조직 공학에 이점을 제공합니다. 그러나, 3 차원 조직 세포 또는 지원 비 계 시드 없이 날조를 위한 몇 가지 사용할 수 있는 방법이 있다. 이전에, 우리는 비 접착제 agarose 우물으로 셀 시드 여 자기 조립된 조직 반지를 날조를 위한 시스템을 개발. 음수입니다 (PDMS) 처음 가공된 폴 리카 보 네이트 몰드, 캐스팅 그리고 agarose는 gelled 고리 모양의 셀 시드 웰 스를 만드는 부정적인 PDMS에. 그러나,이 접근의 다양성은 폴 리카 보 네이트 몰드 가공에 사용할 수 있는 도구의 해상도 의해 제한 되었다. 여기, PDMS 원판 날조를 위한 3D 인쇄 플라스틱 가공된 폴 리 카보 네이트 하는 대신 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 3D 인쇄 형과 개정된 형 디자인은 사용 하 여 간단 하 게, 생산, 저렴 하며 훨씬 더 적은 agarose 및 PDMS 잘 시드 셀 당. 우리가 시연 결과 agarose 웰 스 다른 세포 유형의 다양 한 사용자 지정 된 직경 자기 집합된 조직 반지를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 링 기계, 기능, 및 조직학 분석을 위해 또는 더 크고 복잡 한 관 조직 조작에 대 한 사용할 수 있습니다.

이 시스템은 간단 하 고, 고리 모양의 3D 자기 집합의 셀 수 있도록 agarose 셀 시드 웰 스의 사용자 정의 제조 설계 조직 허용 합니다. 3D 인쇄 보다 크기는 사용 가능한 도구 크기에 의해 제한는 폴 리카 보 네이트 가공 금형 설계에 더 나은 해상도 더 큰 유연성을 허용 한다. 고해상도 3D 프린터 0.254 m m로 얇은 벽은 인쇄 될 수 있다와 여 물통 크기 (15.2 µ m 해상도 이러한 연구에 대 한) 프린터의 해상도 의해서만 제한 됩니다. 일반적으로, CNC 엔드밀 미만 0.3 m m 그래서 되지 않습니다 상용, 작은 폭의 골짜기를 만들 수는 없습니다. 마이크로 밀링 작은 기능을 생성할 수 있다, 장비 필요 하지만 엄청나게 비싼 또는 많은 생물 의학 연구 실험실에 액세스할 수 있을 수 있습니다. 여 물 크기와 곡률도 엔드밀 팁 모양에 의해 제한 됩니다. 또한, 기능 같은 각도 또는 테이퍼 벽은 가능, 고 작은 기능 가공 과정에서 휴식 수 있습니다.
CAD 드로잉 금형 3D 인쇄 및 사용자 정의 크기의 PDMS 원판을 생산 하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 그림 3 에서는 우리의 현재 2mm 게시물 3D 인쇄 형의, 이전 디자인 반복에 비해 크기를 설명 합니다. 과정은 비싼; 2 mm, 5-링 3D 인쇄 형 3d 인쇄, 44.67 달러 비용과 각 부분 여러 PDMS 네거티브를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 우리는 단일 3D 인쇄 형에서 30 개 이상의 PDMS 원판 만들었습니다. 각 부정적인 g (PDMS 부정적인 당 2.75 달러) 당 0.11 USD에서 PDMS의 25 g을 필요합니다. 각 PDMS 부정적인 압력가 마로 소독, 세제로 청소 하 고 다시 사용의 주파수에 따라 몇 년까지 사용 수 있습니다. 원래 디자인18에 비해 소형 3D 인쇄 형 사용 하 여 상당히 적은 PDMS 2mm 조직 반지 (그림 1E) 당 agarose.
셀 집계 미만의 24 h. 반지 치수 agarose 우물의 크기에 따라 달라 집니다 양식 조직 반지 equilibrated agarose 스에서 시드. 여기, 우리는 자기 조립된 쥐 평활 근 셀 링 2, 4, 또는 12 mm 직경 게시물 (그림 4)와 웰 스에서 날조 될 수 있다 설명 했다. 이 연구에서 반지만 3 일에 대 한 교양 했다, 우리는 이전 최대 2 주22, hSMC 반지를 경작 및 hMSC-연골 링으로 최대 3 주13. 이전에 보고 된, 반지 수 작동 3D 생체 외에서 조직에 대 한 양적 평가 대 한 인간의 조직 기능11 및 기계적 강도13,22, 모델과 모듈 건물 단위를로 봉사 할 수도 튜브 모양의 조직 구조7,13을 생성 합니다. 시드 조건 셀 고이 셀 형식에서 설계 조직 반지의 기능 특성 표 1에 요약 되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> 그림 1: 폴 리카 보 네이트 몰드 디자인. 처음에, 15 잘 금형 폴 리 카보 네이트 (A)에서 가공 했다. 이후 버전 6 잘 플레이트의 한 잘 내 단일 폴 리 카보 네이트 형에 맞게 설계 된 5 웰 스와 더 컴팩트한 디자인 (B)를 선보였습니다. 여기, 우리는 가공된 폴 리 카보 네이트 (C)에 더 많은 사용자 정의 대신 3D 인쇄 플라스틱을 사용 하 여이 디자인을 수정. (D) 표시는 agarose 웰 스는 초기에서 조작 디자인18 (왼쪽) (오른쪽), 현재 소형 디자인에 비해 훨씬 적은 agarose를 요구 하 고 우물의 수동 분리를 필요 하지 않습니다. PDMS의 agarose 각 디자인 반복에 필요한 수량 (E)에 표시 됩니다. 센터 포스트는 직경에서 2 밀리미터. (A) 형 6 cm x 12 cm, (B)는 5 cm 직경, 그리고 (C)는 6 cm 직경입니다. 눈금 막대 (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> 그림 2: 자기 집합된 조직 반지의 제작. 3D 인쇄 형 agarose 웰 스 (A)를 캐스팅 하는 데 사용 되는 PDMS 부정, 캐스팅 하는 데 사용 됩니다. 셀은 다음 agarose 웰 스, 그들은 양식 조직 반지 (B)에 24 시간 미만에 집계에 직접 시드. (B)에서 파선 잘 개요를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> 그림 3: 3D 인쇄 형 CAD 드로잉의 횡단면 뷰. 구 유 폭 (A), 여 물 높이 (B), 센터 구멍 (C), 총 직경 (D), 외부 립 (E), 그리고 외부 벽 높이 (F)에 대 한 치수 표시 됩니다. 외부 벽 (1), 웰 스 (2), 및 센터 구멍 (3)의 상단 부분 (2 대 1, 3, 45 ° 5 ° 각도)에서 PDMS 부정적인 제거의 용이성을 개선 하기 위해 테이퍼 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> 그림 4: 해당 PDMS 원판으로 CAD 도면 및 자기 조립된 SMC 반지 2 (A), 4 (B)와 (C) 12mm 직경 게시. (A), (1) 오리 엔 테이 션을 제공 하기 위한 노치를 나타냅니다, (2) 나타냅니다 관류를 개선 하기 위해 중앙 구멍, (3) PDMS 원판에 직접 인쇄물, 파일 번호 이며 (4)는 외부 벽, PDMS 부정적인 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼입니다. Agarose 스에서 바 규모 = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>셀 유형</td>
			<td>셀 링 당 시드</td>
			<td>링 직경</td>
			<td>문화 기간</td>
			<td>기능 분석 수행</td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐 SMC</td>
			<td>0.5, 1 또는 3 x 106
</td>
			<td>2, 4, 또는 12 mm</td>
			<td>3 일</td>
			<td>현재 연구; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC 파생 SMC 11
</td>
			<td>0.6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 일</td>
			<td>수축 테스트, 단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간의 SMC 22
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 일 또는 14 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간 MSC 14
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석, 반지 퓨전 및 튜브 압축 테스트, 연골 조직으로 차별화</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 셀 번호 다른 세포 유형에서 반지 제작에 필요한.

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Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. 이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

연구

생체공학

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

액상 사출 성형을위한 3D 인쇄 금형을 사용하여 의료 기기의 신속하고 저렴한 프로토 타이핑

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a conventional optical system with an integrating sphere. Measuring systems for the acquisition of the diffuse reflectance and total transmittance spectra are constructed with a broadband white light source, a light guide, an achromatic lens, an integrating sphere, a sample holder, an optical fiber probe, and a multi-channel spectrometer. An acrylic mold consisting of two rectangular acrylic pieces and a U-shaped acrylic piece is constructed to create an epidermal phantom and a dermal phantom with whole blood. The application of a sodium dithionite (Na2S2O4) solution to the dermal phantom enables the researcher to deoxygenate hemoglobin in red blood cells distributed in the dermal phantom. The inverse Monte Carlo simulation with the diffuse reflectance and total transmittance spectra measured by a spectrometer with an integrating sphere is performed to determine the absorption coefficient spectrum &#181;a(&#955;) and the reduced scattering coefficient spectrum &#181;s&#39;(&#955;) of each layer phantom. A two-layered phantom mimicking the diffuse reflectance of human skin tissue is also demonstrated by piling up the epidermal phantom on the dermal phantom.

Here, we demonstrate how agarose-based tissue-mimicking optical phantoms are made and how their optical properties are determined using a conventional optical system with an integrating sphere.

Agarose 기반 조직 확산 반사율 분광학에 대 한 광학 환영을 흉내 낸

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...