Name: determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
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이 연구는 국립 연구소에 의해 투자에 대 한 일반 의료 과학 (NIGMS) (5605100122001), 국립 보건원 (NIH), 뿐만 아니라 키 니 (UNK) 여름 학생 연구 프로그램 (SSRP) 그리고 UNK 네브라스카 대학교의 구성 요소 학부 연구 친교 (URF)입니다.

1. 염료, 버퍼의 Agarose 젤 준비
<ol><li>
얼룩이 DNA 또는 스테인드 DNA의 소화에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 x 테 (Tris HCl 및 ethylenediaminetetraacetic 산; 준비 EDTA) 버퍼 10 mM Tris HCl과 1 mM EDTA 졸업된 실린더 또는 부피 측정 플라스 크를 사용 하 여. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.</li>
		<li>각 염료의 aliquots 만들기: 토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 보 보-3 (표 1). 어두운 주황색으로 1mm 염료의 4 µ L 플라스틱 또는 블랙 1.5 mL 튜브 및 1 x 테의 36 µ L을 추가, 피 펫을 사용 하 여 혼합 이 집중은 100 µ M 염료 솔루션 (총 40 µ L)입니다. 각 염료에 대 한이 단계를 완료 합니다. 4 ° c.에 게 참고: photobleaching 또는 염료의 저하를 방지 하기 위해 빛을 염료를 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>1 10 mM Tris, Bis, HCl, 프로 판, 10 m m MgCl2및 100 µ g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 버퍼 2 50 mM NaCl를 사용 하 여 준비 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 100 µ g/mL BSA. 3 50 mM 칼륨 아세테이트, 트리 아세테이트 20 mM, 10 m m 마그네슘 아세테이트, 및 100 µ g/mL BSA를 사용 하 여 버퍼를 준비 합니다. 각 효소 기능을 이러한 특정 버퍼 중 하나 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤 전기 이동 법에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>확인 로드 x 6 블루, 0.25 %bromophenol 결합 하 여 염색 0.25% 자일 렌 cyanol, 15% Ficoll dH2오가 실내 온도에.</li>
		<li>0.7 %agarose 젤, 삼각 플라스 크에 높은 고 온도 (HGT) agarose의 0.07 g 밖으로 무게, 100 mL 1 x TAE 버퍼의 추가 플라스 크 위에 거꾸로 비 커를 배치.<ol>
<li>거품 형태로 플라스 크와 상단에 부동의 하단에 시작 될 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 열.</li>
			<li>핫 플레이트에서 솔루션을 제거, 솔루션 쿨 플라스 크 맨 손으로 건드리지 수 수 웰 스를 만드는 젤 빗 24.5 c m x 21.8 c m 젤 형으로 젤을 부 어 때까지.</li>
			<li>피 펫 팁 터지는 여 빗 근처 또는 젤의 표면에 거품을 제거 하 고 적어도 15 분 동안 공고히 하 젤 허용. 이 젤 또는 오염의 건조를 방지 하기 위해 1 주에 대 한 플라스틱 랩에 싸서 냉장고 (4 ° C)에 저장할 수 있습니다. 젤을 실행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 리 외. 33 . 참고: 30 개별 웰 스와 젤 빗을 사용 합니다. 각 잘 2 m m의 깊이와 폭이 4.5 m m 이어야 한다. 우물의 높이 상자에 부 어 젤의 크기에 따라 달라 집니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>40 mM Tris HCl, 20 m m 초 산, 1 mM EDTA 사용 하 여 1 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA) 버퍼를 준비 합니다. 실내 온도 (18-25 ° C)에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 스테인드 DNA의 준비
<ol><li>
람다 DNA (300-800 ng) 염료의 다른 aliquots를 사용 하 여 얼룩. 각 염료 (표 1) 6 개의 다른 농도 제한 효소 당 48 반응의 총에 대 한 테스트를 할 것 이다. 다음 프로세스 1 반응 (그림 1)에 대 한 최대 집합을 설명합니다.
	<ol>
<li>1 x 테 100을 사용 하 여 람다 DNA를 희석 ng / µ L. 4 ° C에 저장 300 µ L의 총 볼륨으로 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>Unmethylated 람다 DNA 얼룩. 다이제스트에서 예상 각 밴드에 대 한 75-100 ng/밴드 예상. 1.9 µ M, 3.8 µ M, 19.4 µ M, 32.2 µ M, 48.3 µ M, 63.5 μ M의 농도 생산 하는 염료의 적절 한 금액을 추가 / 100 ng의 DNA.</li>
		<li>밤새 품 어 (15-18 시) 4 ° c.에</li>
		<li>한 반응 제어25으로 흠 없는 둡니다. 참고: unmethylated DNA를 사용 하 여 소화 반응에 대 한. 메 틸 화 과민 한 효소 수 없습니다 DNA에 갠 지역 고 불완전 한 소화의 모습을 줄 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 제한 효소 분석 실험의 준비
<ol><li>
다이제스트는 그 효소 prestained DNA (그림 1)을 소화 수 있습니다 경우 결정 하는 제한 효소로 DNA를 스테인드.
	<ol>
<li>다음 날, 제한 효소, 적절 한 버퍼 (표 2)의 3 µ L의 U 20을 추가 하 고 증류수, 압력가 마로 소독 하 고 필터링 된 30 µ L의 총. 각 효소 반응에 대 한 제조업체의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다 가장 높은 절단 효율성으로 버퍼를 선택 합니다.</li>
		<li>반응의 최적 효소 활동, 6 효소 Maschmann 외에 사용에 대 한 표 2에 나열 된 온도에서 물 욕조에 배치., 2-4 h (표 2)25.</li>
		<li>0.5 M EDTA pH 8.0의 2 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting Agarose 젤에서 DNA 스테인드
<ol><li>24.5 c m x 21.8 c m 젤 형 (1.2.2 단계)에서 면을 제거 하 고 젤 젤 전기 이동 법 상자에 놓습니다. 상자에 1 x TAE 버퍼의 2.5 L를 붓으십시오. 조심 스럽게 우물 액세스할 수33그래서, 젤에서 젤 빗을 제거.</li>
	<li>플라스틱 플라스틱 필름에 제한 효소 반응 하 고 염료를 로드 x 6 각 반응 결합. 각 반응 솔루션에 대 한 DNA 솔루션 (1x)의 5-6 µ L 당 염료 로드 x 6의 1 µ L를 추가 합니다. 다음 반응 플라스틱 (로드 염료 포함 된 < 18 µ L) 우물에.</li>
	<li>1 kb 사다리의 1 µ L, 1 x 테의 9 µ L 및 염료 로드 x 6의 2 µ L를 혼합. 다른 솔루션 측면 우물에 솔루션을 로드 합니다.</li>
	<li>어두운 청색 또는 검은색 종이 또는 직물 젤 상자를 커버. 전원 공급 장치, 30 V, 전원 공급 장치를 설정 하 고 그것을 밤새 껏 달린다 (15-20 h)에 젤 상자를 연결 합니다. 젤 레이블이 DNA의 photocleavage를 방지 하기 위해 실행 되는 동안 불을 끕니다.</li>
	<li>다음 날 아침에 전원 공급 장치 해제. 트레이 사용 하 여 밖으로 젤 하 고 45 µ L ethidium 평범한 사람 및 1 x TAE 버퍼의 1 L 용기에 그것을 전송. 빛에 노출 되지 않도록 호 일에 어둠 속에서 실내 온도 또는 표지에 컨테이너를 저장 합니다. 실내 온도에 적어도 45 분 동안 하자 젤 얼룩. 주의: 장갑 ethidium 평범한 사람을 사용 하 고 안전 안경을 착용. Ethidium 평범한 사람 해결책을 포함 하 고 젤을 버리고 컨테이너를 청소 때 참조 사용된 ethidium 평범한 사람; 처리 하는 방법을 결정 하는 상태 처리 지침 서 또한, 다른 얼룩 ethidium 평범한 사람 대신 이용 될 수 있습니다.</li>
</ol>5. 이미징 Agarose 젤
<ol><li>400-500 nm 사이 최대 광 출력을 방출 하는 블루 빛 transilluminator의 위에 젤을 놓습니다. 역에 연결 된 카메라와 함께 사진을 찍을. 주의:는 조명에 대 한 커버를 사용 하 여 광원을 켜기 전에 보호 안경에 넣어 있는지 확인 합니다. 참고:이 단계 수 있습니다 또한 완료 모든 UV 광원 또는 표준 젤 스캐너를 사용 하 여.</li>
	<li>ImageJ ImageJ 상태 표시줄에 파일을 드래그 하 여 그림 목록 그리고 이미지 팝업 됩니다.</li>
	<li>예상 에서 실리콘에서 젤 패턴에 젤에 밴드를 비교 하 여 실험에 대 한 소화 속도 결정 합니다. 소화 속도 결정 하기 위해 실험적인 밴드의 수 DNA 밴드24,25의 예상된 수로 나눕니다. 실험적인 소화 DNA 밴드 패턴 예상된 패턴을가지고, 소화 율은 1입니다. 패턴에 경우 예상 보다 더 많은 파편, 소화 속도가 1 보다 큰입니다. 패턴에 경우 예상 보다 적은 조각, 소화 속도가 1 미만입니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

붙일 레이블된 DNA (그림 1)을소화 하기 위해 일련의 단계를 제시해 주셔야 합니다. 첫째, DNA 하룻밤는 형광 색소로 얼룩진입니다. DNA 수 있습니다 알을 품 cyanine 이합체와 시간;의 짧은 기간에 대 한 그러나, Carlsson 외. 발견 DNA 이중 밴드 때문에 불완전 한 얼룩20각 DNA 크기에 대 한 만든. 이 문제를 해결 하려면 DNA 수 있습니다 얼룩이 질 더?...

토토 시리즈 (토토-1, 요요-1, 포포-1, 보 보-1, 토토-3, 요요 3, 포포-3, 그리고 보 보-3; 표 1) DNA의 시각화가 필요한1,2,3,,45,6,7, 실험의 다양 한 활용 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. cyanine 이합체 가족은 그들의 양자 수율, 감도, 및 DNA 분자18,,1920에 대 한 높은 선호도 널리 사용 된다. Cyanine 이합체 염료 좋은 선택도 두 배 좌초 된 dna와 삽입 된 형광21의 100 ~ 1000 배 증가 했습니다. Pyridinium 염료 (요요-1, 토토 1, 요요-3, 그리고 토토-3) 그들의 quinolium (보 보-1, 포포-1, 보 보-3, 그리고 포포-3) 대응 (표 1)22염색 보다 짧은 방출 파장을가지고. 또한, DNA로 삽입 된 cyanine 이합체의 양자 수율은 높은 (0.2-0.6)22. 그러나, DNA 분자2 의 메 틸 프로필을 확인 하거나 스트레칭23 형광 염료와 스테인드 이미 DNA 분자의 효소를 사용 하 여 어떤 효소 스테인드 DNA를 소화할 것 이다 결정 하는 방법을 필요 합니다. 모든 종류의 DNA에 intercalates 염료 또는 어떤 효소 DNA 기판의 뚜렷한 패턴을 제공 하는이 방법에 대 한 사용할 수 있습니다.
멩 외. 먼저 prestained DNA 젤 전기 이동 법 다른 염료24의 다양 한 사용을 통해의 소화 속도 결정. Maschmann 외 에 파 놓은 광산 염료의 토토 가족 보고 깊은. 둘 다 특정된 염료와 스테인드 DNA 제한 효소25소화 수 경우 보고 스테인드 DNA의 소화 속도 결정. 다른 방법 광학 핀셋26 또는27NMR 사용 하 여 DNA로 삽입 된 염료의 바인딩 효과 연구. 어느 방법을 사용 하려면 전문된 장비; 반면,이 방법을 사용 하면 대부분의 분자 생물학 실험실 염료를 결정 해야 하는 장비는 금지 효소 소화를 방해 합니다.
또한, 주어진된 분자의 길이 측정 하는 다른 방법, 광학 매핑 표면에 흠 없는 DNA 분자를 길쭉한 있으며 스트레치 조각의 크기를 결정 하는 DNA를 소화. 염료의 윤 윤곽선 길이 놓여있는지 스테인드 DNA 분자와 염료 사용에 따라 증가 표시 되었습니다, 그리고 윤곽선 길이 다른21. 이 메서드는 게놈1,3,4,6,13,,2829,30, 의 다양 한 이용 그러나 31., 분자 염료 및 효소에 따라 미리 묻은 경우, 효소 수 없습니다 특정된 염료와 스테인드 DNA를 잘라. 따라서,이 메서드는 특정된 염료와 스테인드 DNA 효소와 함께 소화 수 있습니다 경우 결정 합니다. 또한, 염료와 염료 활용, DNA의 이동성의 농도 따라 젤에 밴드 마이그레이션됩니다32의 기본적인 쌍 사이 삽입할 염료에 대 한 공간을 만들기 위해 DNA 등뼈의 부분 해제로 인해 네이티브 DNA 보다는 더 느리게 .
그러나, 때로는 이러한 염료 수 부분적으로 또는 완전히 특정 제한 효소7,24의 행동을 억제. 이 효소의 특정 시퀀스를 인식 되지 않을 수 있습니다 형광 염료의 부착으로 인 한 DNA 구조 변경 생각 이다. 이러한 염료 제한 효소에 미치는 영향을 이해 실험 메 틸 프로필 또는 스테인드 DNA의 스트레칭은 필요에서 도울 수 있다.
우리의 방법에 DNA의 형광 색소로 얼룩진 고 금지 효소로 소화. 다음 DNA 몇 군데, 젤에 electrophoresed 되었다 그리고 금지 효소 소화 속도 측정 했다. 금지 효소에는 젤 컷된 패턴에 따라 선택 되었다. 너무 많은 악대 DNA 밴드의 중복 발생 하 고 너무 몇 밴드 DNA 분자의 완전 한 그림을 포기 하지 않았다. 명당; 소화 DNA 분자의 프로필을 확인할 수 있다 따라서, 그것은 사용 하는 DNA, 효소에 따라 달라 집니다. 이 방법의 장점은 단순; 그것만 제한 소화와 젤 전기 이동 법에서 사용 하는 장비를 요구 한다.

<table><tbody><tr><td>Unmethylated lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Corrosive and irritant</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>High gelling temperature agarose gel</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Wear correct eyewear&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I camera</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic Power Supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA의 시각화 cyanine 염료 등 염료의 다양 한을 사용합니다. 이 염료는 DNA에 대 한 그들의 높은 선호도와 감도 활용 됩니다. DNA 분자는 실험의 완료 후 전체 길이 인지 파악 하는 방법 스테인드 분자 DNA를 제한 효소로 소화 하 여 전체 길이 인지 확인 필요 합니다. 그러나, 스테인드 DNA 메서드 하나 형광 색소를 사용할 수 있는 어떤 효소 DNA 스테인드 결정 하는 데 필요한 그래서는 효소를 억제 수 있습니다. 이 방법에서는 DNA는 염료 및 DNA equilibrate를 하려면 밤새 cyanine 염료와 스테인드. 다음, 스테인드 DNA는 제한 효소로 소화, 젤에 로드 이며 electrophoresed. 실험적인 DNA 다이제스트 밴드 제한 효소의 활동을 결정 하기 위해 실리콘에 다이제스트 비교 됩니다. 만약 예상 대로 동일한 수 밴드의 있으면, 반응 완료 됩니다. 더 밴드 부분 소화를 나타내는 예상 보다 적은 밴드 불완전 소화를 나타냅니다. 이 방법의 장점은 단순 하 고 그것은 그 과학자는 제한 효소에 대 한 필요 장비를 사용 하 여 시험 하 고 젤 전기 이동 법. 이 방법의 한계는 대부분의 과학자 들은 수 효소는 상업적으로 이용 가능한 효소; 그러나, 어떤 제한 효소 사용 될 수 있습니다.

경우 intercalating 염료는 DNA를 소화 하는 제한 효소에 영향을 미칠 것 이다, 단계의 올바른 순서로 되어야 합니다 확인 (그림 1)를 따 랐 다. 일단 DNA 스테인드 이며 특정된 효소로 소화, 조각 및 그들의 크기 (그림 2)의 수를 결정 하 젤의 그림을 취할 수 있습니다. 위하여 효소 효율을 보이는 밴드의 수로 나눈 예상된 보이는 밴드의...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.

DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.7K 조회수.  University of Nebraska - Kearney. 형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

연구

생화학

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

유전학

학부 연구 및 교육을 위한 염색체 형태 캡처(3C)

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

저자 스포트라이트: 3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 포착  

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

생물학

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

<meta charset="utf8"></head><body>단일 분자 분석을 사용한 텔로머 DNA와의 TRF1/2 상호 작용 연구

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 조사를 위한 고급 단일 분자 기법

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.

DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

요약

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드로소필라 세포의 인핵 하이-C

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석