핵 Hi-C 프로토콜은 게놈을 구성하는 크로마틴 루프, 도메인 및 구획의 특성화를 위한 다른 해상도에서 염색체 확인의 탐구를 허용합니다. 이 프로토콜은 다양한 비늘에서 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링을 제공하여 전체 범위의 게놈 거리및 데이터 범위에 걸쳐 기술적 소음이 적은 보다 일관된 커버리지를 제공합니다. 이 프로토콜을 유전자 편집과 결합하는 것은 유전 적 요소의 구조적 기능을 테스트하기위한 강력한 전략입니다.
그것은 또한 질병으로 이끌어 내는 구조적인 변이의 특성화에 적용될 수 있습니다. 핵 Hi-C 프로토콜은 어떤 진핵 게놈의 게놈 조직을 탐구하기 위하여 적용될 수 있습니다. SDS 및 Triton 처리를 수행하면 응집체가 효소 반응 효율을 방해하고 시퀀싱 전에 적절한 품질 제어 측정을 수행하므로 파이펫팅으로 핵 덩어리가 분해됩니다.
7회 슈나이더의 라인 2 Plus 드로소필라 세포에 메탄올 프리 포름알데히드를 10회 10회에 추가하여 슈나이더 배지의 17.5 밀리리터에 10%의 FBS를 보충하여 60초마다 혼합하거나 회전하는 휠에 10분 동안 세포를 배양하고, 글리신을 최종 12.02의 마지막 농도로 혼합하여 10분간 첨가합니다. 실온에서 5분, 얼음에서 15분 후에, 원심분리로 세포를 수집하고 차가운 PBS의 25밀리리터에서 펠릿을 조심스럽게 재보습하고 또 다른 원심분리로 세포를 수집합니다. 원심분리의 끝에서, 계산을 위한 얼음 냉용 리시스 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 재보중단하고 밀리리터 농도당 6개의 세포로 10번으로 세포를 조정한다.
30 분 동안 얼음에 세포를 배양하고, 튜브를 2 분마다 반전하여 다른 원심 분리와 세포를 혼합하고 수집합니다. 신선한 얼음 차가운 리시스 버퍼의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 원심 분리 후 1.25X 제한 버퍼1밀리리터로 리세이트세척을 세척합니다.
다시 원심 분리기는 lysate를 수집합니다. 360 마이크로리터의 신선한 제한 버퍼와 11 마이크로리터의 펠릿을 37°C에서 45분 동안 조심스럽게 배관하고 배양하여 가끔 파이프팅으로 분당 7~950회전을 반복합니다. 인큐베이션의 끝에서, 비 이온 계면활성제의 75 마이크로 리터와 투과화를 중지하고 가끔 파이펫으로 분당 950 회전에서 흔들림과 추가 45 분 동안 인큐베이터에 튜브를 반환합니다.
크로마틴 소화의 경우, 200단위의 Mbo1을 튜브에 넣고 회전시 섭씨 37도에서 4~16시간 배양에 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 60°C에서 20분 배양으로 효소를 비활성화합니다. 제한 조각 오버행을 채우고 DNA끝을 비오틴으로 표시하려면, 각각 10 밀리머 dCTP, dGTP, dTTP, 0.4 밀리머 비오틴 dATP의 20 마이크로리터, 17.5 마이크로리터 낮은 EDTA 버퍼, DNA 폴리머의 마이크로리터 당 5 단위의 10 마이크로 리터를 추가하십시오.
30초 동안 10초마다 분당 700회전에서 흔들림으로 섭씨 37도에서 75분간 반응을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 크로마틴에 결찰 믹스를 추가하고 철저한 부드러운 혼합과 16섭씨에서 하룻밤 동안 배양1 밀리리터 최종 반응 볼륨으로 조정합니다. 시료 단백질을 저하시키려면 밀리리터 단백질Ase K당 10밀리그램의 50마이크로리터를 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 2시간 배양에 넣습니다.
인큐베이션이 끝나면 밤새 온도를 섭씨 65도로 늘려 시료를 교차 연결합니다. 다음 날 아침, 밀리리터 RNA A.37도에서 1시간 후, 10마이크로리터의 10마이크로리터로 RNA를 분해하고, 1부피의 페놀 클로로폼을 튜브에 추가하고 반전을 통해 균질한 백색 상을 얻습니다. 표준 프로토콜에 따라 DNA를 침전시킨 후 제조업체의 지침에 따라 DNA와 불소계에 선택적으로 결합되는 불소염염을 사용하여 DNA를 정량화합니다.
소화되지 않고 소화된 알리쿼트에서 DNA를 정화하려면 소화되지 않은 100나노그램의 소화되지 않은, 소화 및 계각 샘플을 1.5% 아가로즈 젤에 적재하고 소화된 시료에 500개의 베이스 쌍을 중심으로 한 얼룩을 찾아내고, 리게게드 된 시료에 대한 고분자 중량 대역에 대한 고분자 량 대역을 찾아보세요. 알려진 상호 작용의 증폭 및 소화에 의한 Hi-C 마킹 및 결찰 효율을 확인하기 위해, PCR 후, Mbo1, Cla1 또는 둘 다로 제품을 소화하고, 3C 및 Hi-C ligation 접합의 상대적 수의 추정을 허용하기 위해 새로운 1.5 ~ 2%젤에서 샘플을 실행한다. 200 ~ 500개의 염자 DNA 단편을 얻기 위해 시료를 초음파 처리한 후, 각 샘플에서 5마이크로그램의 DNA를 가진 130마이크로리터를 10X 결찰 버퍼 16마이크로리터, 10밀리머 dATP의 마이크로리터 2개, T4 DNA 폴리머라제 5개 소리터, 20도에서 20분 간 이중 증류수 7마이크로리터를 포함하는 새로운 마이크로센심심분리기 튜브로 이송합니다.
인큐베이션의 끝에서는 10밀리머 dNTPs 5개, 10X 결찰 버퍼의 마이크로리터 4개, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5개, DNA 폴리머라제 1개 마이크로리터 1개, 이중 증류수 25마이크로리터를 20분 동안 튜브에 25마이크로리터를 첨가한다. 주로 250 ~550베이스 쌍 크기 범위에서 단편을 선택하려면 제조업체의 지침에 따라 0.6X로 순차적인 고체 위상 가역 및 동원 크기 선택을 수행한 다음 100 마이크로리터의 TRIs 낮은 EDTA로 DNA를 엘ute하십시오. 각 라이브러리의 비오틴 풀다운의 경우, 스트렙타비딘과 연결된 마그네틱 비즈 150마이크로리터를 1X Tween 버퍼 400마이크로리터로 두 번 세척하고 회전 휠에서 3분 동안 샘플을 회전시로 회전시합니다.
인큐베이션이 끝나면 2X 노 트위엔 버퍼의 300 마이크로리터로 구슬을 재연하고 300 마이크로리터의 Hi-C 재료와 혼합하여 회전 휠에서 30분 회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 구슬을 0.5X Tween 버퍼 400마이크로리터로 세척하여 분당 섭씨 55도, 분당 750회전으로 3분간 배양하고, 세척당 1X 제한 완충제 200마이크로리터에 2개의 세척을 넣습니다. 두 번째 세척 후, 37섭씨에서 30분 동안 dATP 테일링 믹스 100마이크로리터로 구슬을 재차판으로 재보선다.
인큐베이션의 끝에서, 1X 결찰 버퍼의 50 마이크로리터에서 구슬을 재연하고 4개의 마이크로리터 를 포함하는 새로운 튜브로 서스펜션을 이전하고 T4 리게아제의 2개의 마이크로리터를 사전 아닐로 한 쌍끝 어댑터로 옮긴다. 실온에서 2시간 후, 상체를 제거하고 400마이크로리터의 Tween 버퍼로 구슬을 두 번 세척한 다음, 트위엔 버퍼가 없는 200 마이크로리터로 한 번, 1X 제한 버퍼의 40 마이크로리터로 구슬을 다시 일시 중단합니다. Mbo1에 대한 제한이 성공할 때 200 ~ 1, 000 베이스 쌍의 얼룩이 관찰됩니다.
결찰이 성공하면 겔 의 상부에서 높은 분자량 밴드가 관찰됩니다. 소화 효율은 또한 정량적인 PCR에 의해 확인될 수 있습니다. 허용 가능한 소화 효율은 80% 이상입니다.
그림과 같이, Hi-C 결찰 제품에서 알려진 중거리 상호작용의 증폭은 증폭에서 회수된 PCR 제품의 소화에 의해 추정될 수 있다. 시퀀싱 후 라이브러리에 대해 유용하지 않은 읽기의 큰 비율을 사용하지 않도록 70 % 이상의 소화 효율을 권장합니다. 최종 증폭을 위한 PCR 사이클의 수는 얼룩이 보이는 사이클 수보다 한 주기 적어야 합니다.
라이브러리의 소화 수준은 유효한 Hi-C 쌍의 풍부를 나타내며 라이브러리에서 얻을 수 있는 유용한 읽기의 비율을 반영합니다. 고유한 유효한 Hi-C 쌍을 사용하여 쌍 분포의 기본 분석을 수행할 수 있습니다. 이 대표적인 예에서 관찰된 바와 같이, NOTCH 유전자 궤적은 건축 단백질, 1 및 2개의 도메인 및 궤적을 따라 히스톤 수정과 함께 볼 수 있다.
CTCF와 M1BP DNA 결합 부위를 모두 포함하는 영역의 삭제 시 크로마틴 접점의 극적인 변화를 관찰할 수 있다. Hi-C 실험 후, 프로모터 영역과 같은 특정 접접촉 집합에 도달하기 위해 수행될 수 있다. 이것은 큰 게놈을 평가할 때 특히 유용합니다.
입증된 바와 같이, Hi-C 프로토콜과 유전적 첨가를 결합하면 유전체 원소의 구조적 및 조절 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
