우리는 특히 마우스의 부비동 및 AV 노드에서 형광 활성화 세포 분류에 의한 심장 상주 미세 파지의 미세 해부 및 후속 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 부비동과 V 노드의 정확한 미세 해부와 자기 및 형광 활성화 세포 분류의 조합을 통해 부비동과 V 노드에서 상주하는 대식세포를 고순도로 특이적으로 분리할 수 있습니다. 심장의 별개의 영역에서 심장 상주 대 식세포를 식별하고 분리하면 표현형과 심장 전기 생리학에 대한 영역 별 영향을 추가로 연구 할 수 있습니다.
심장을 분리 한 후 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 일회성 PBS로 해부 접시에서 미세 해부 절차를 수행하십시오. 대동맥, 폐동맥, 관상 동맥, 좌심실 또는 우심실과 같은 심장 해부학적 랜드마크를 사용하여 심장의 좌우 및 전후방을 결정합니다. 방향이 결정된 후, 접시의 바닥에 앞쪽으로 심장을 위치시켜 뒤쪽의 큰 정맥을 노출시킵니다.
심실과 심방 사이의 홈을 따라 잘라 심실의 대부분을 제거하십시오. 심방 부분을 유지하십시오. LV 프리 벽과 LAA의 나머지 부분을 통해 핀을 삽입하여 해부 접시에 심장을 고정합니다.
나머지 RV 자유 벽을 삼첨판 막과 상대 정맥을 통해 위쪽으로 자릅니다. RA와 RV를 뒤집고 RAA를 고정하여 RA 캐비티 인터카발 영역과 심방 중격을 노출시킵니다. SAN의 미세 해부의 경우, 크리스타 말단과 평행 한 심방 중격을 따라 심장을 절단하여 CAVAL 영역을 분리하여 SAN 샘플을 얻습니다.
얼음 위의 빈 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 샘플을 넣으십시오. AVN의 미세 해부의 경우, 심방 중격 및 심실 중격에 인접한 조직을 통해 심장의 나머지 부분을 고정하여 심방 중격의 우심방을 향하게합니다. 삼첨판 막의 중격 전단지의 힌지 라인에 의해 앞쪽으로, Todaro의 힘줄에 의해 뒤쪽으로 경계가 될 Koch의 삼각형에 대한 심내막 표면의 우심방을보십시오.
관상 동맥의 구멍이 기저부에서 관찰됩니다. 메스로 SAN 및 AVN 조직을 다진다. 그런 다음 새로 준비된 500 마이크로 리터의 소화 완충액을 각 샘플에 추가하고 마이크로 원심 분리 튜브의 벽에서 다진 모든 조직을 씻습니다.
부드럽게 피펫팅하여 샘플을 소화하고 와류 기계에서 조직을 균질화합니다. 소화 후 조직 현탁액을 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과시켜 새로운 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 여과기를 추가로 5밀리리터의 세포 분류 완충액으로 헹구어 소화를 중지합니다.
상청액을 제거하십시오. 90 마이크로리터의 세포 분류 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨 후, 총 세포 1,000만 개당 10 마이크로리터의 CD45 마이크로비드를 15 밀리리터 원심분리 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다. 샘플을 잘 섞는다.
세포 현탁액을 마이크로비드 및 항체 혼합물과 함께 인큐베이션하는 시간 동안, 자성 컬럼을 적합한 자기 분리기에 부착한 다음 자성 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치하여 자기 분리 세트를 준비합니다. 컬럼 상단에 추가된 500마이크로리터의 세포 분류 버퍼로 헹구고 버퍼가 통과하도록 하여 마그네틱 컬럼을 준비합니다. 세포 분류 버퍼가 통과하는 동안 기포를 피하면서 세포 현탁액을 컬럼에 즉시 적용합니다.
컬럼을 500 마이크로리터의 세포 분류 완충액으로 3회 세척한다. 1밀리리터의 셀 분류 버퍼를 컬럼에 추가합니다. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 놓습니다.
컬럼과 함께 제공된 플런저를 단단히 적용하여 컬럼을 즉시 플러시하여 자기적으로 표지된 세포를 포함하는 플로우 스루를 얻었다. 염색되지 않은 샘플과 보정 튜브를 적용한 후 각 채널의 전압을 조정하여 양극 및 음극 피크를 축의 적절한 위치에 정렬합니다. DAPI를 실행 가능성 마커로 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 게이팅 전략을 설정합니다.
유세포 분석 차트를 확인하여 관심 있는 세포 집단이 차트에 제대로 표시되는지 확인합니다. 분류된 세포를 배지 또는 완충액으로 수집하여 후속 실험의 필요성에 기초한다. 정확한 해부를 확인하기 위해 SAN 및 AVN의 식별은 면역 형광 및 Masson의 삼색 염색을 사용하여 수행되었습니다.
SAN 및 AVN에서 HCN4 양성 전도 시스템 세포의 면역형광 염색과 SAN 및 AVN의 Masson's 트리크롬 염색이 여기에 표시됩니다. 상주 심장 대 식세포의 세포 분류를위한 게이팅 전략은 y 축의 전방 산란 영역과 x 축의 전방 산란 영역에서 이중선을 배제하여 단핵 세포를 식별하는 데 도움이되었습니다. 죽은 세포는 DAPI에 의해 제외되었습니다.
살아있는 세포는 CD45 양성 백혈구에 대해 게이팅되었고, 이어서 CD11b 양성 골수성 세포에 대해 게이트되었습니다. 심장 대식세포는 F4/80 및 CD64 둘 다의 발현에 의해 확인되었고, 이어서 림프구 항원 6 발현에 의해 계층화되었다. 갓 분류된 세포를 명시야 현미경 하에서 관찰하였다.
세포는 형광단 PE 채널 하에서 관찰되었을 때 CD45에 대해 양성이었다. APC 크기 7채널 형광단하에서 관찰하였을 때, 정렬된 세포의 동일한 보기는 CD11b 양성 세포를 나타내었다. 형광단 PE 크기 7 채널을 F4/80 양성 표현형을 확인하기 위해 사용하였다.
그리고 삼중 양성 세포는 심장 상주 대식세포로 확인되었다. 최대 6 일 동안 배지에서 배양 된 분리 된 심장 대 식세포는 흰색 화살표로 표시되고 검은 색 화살표는 죽은 세포를 나타냅니다. 분류된 대식세포는 패치 클램프 실험과 같은 추가 기능 연구 또는 RNA 시퀀싱 또는 단백질체학 연구와 같은 발현 연구에 사용할 수 있습니다.
