Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

저자는 소중한 의견 및 우리의 원고의 철저 한 독서에 대 한 S Y 최 (전남 대학교) 감사합니다. 이 작품은 충남 대학교의 연구 기금에 의해 지원 되었다.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>PEUI(+)의 MCS에 적절 한 제한 효소 인식 사이트 (또는 사이트)을 선택 하 고 원하는 방향으로 (그림 1) 관심사의 유전자를 subclone. 참고: EGFP 또는 플래그 피토 프 태그 ankyrin 반복 도메인 13A EcoRI 사이트에 시퀀스 및 결 찰-독립적인 방법19를 복제 T4 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 pEUI(+) 벡터의 transgene (ANKRD13A) subcloned 이었다.</li>
	<li>37 ° c.에서 1 h EcoRI와 pEUI(+) 선형화 믹스 50 ng / µ L의 PCR 증폭 EGFP 또는 ANKRD13A, µ 40 ng/L 함께 pEUI(+) 선형화 및 T4 DNA 중 합 효소 (1 U) 10 분에 대 한 얼음에 부 화 하기 전에 실내 온도 (RT)에 1 분 동안 추가 10 µ L의 100 µ L 직접 반응 혼합물의 반응 다음 변환에 대 한 DH10B 유능한 세포 실험. 참고: 몇 가지 제한 효소 인식 사이트 pEUI(+) (그림 1B)의 MCS에 추가 된, 있지만 좋습니다 EcoRI 사이트에 대상 유전자 subcloning 결 찰 독립적인 복제 기술19,20를 사용 하 여.</li>
	<li>연속 삽입을 확인 하 고 transfection 적합 DNA 정제 키트를 사용 하 여 DNA를 정화.</li>
</ol>2. 과도 Transfection 및 Teb 치료
<ol><li>4 셀 문화 요리 (60 m m 직경) 5-10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 항생제 (100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스) 보완 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 5 mL에 갓 passaged HEK293 세포를 준비 합니다. 여기서 부터는, "세포 배양 매체" 또는 단순히 "문화 매체" FBS와 항생제 보충 DMEM을 나타냅니다. 37 ° c.에 HEK293 세포 유지</li>
	<li>HEK293 세포 transfection 시 약의 3 µ L를 사용 하 여 50-60%의 밀도 순화 된 DNA의 1 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 200 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다. Transfection에 대 한 두 가지 요리를 사용 하 고 다른 두 컨트롤로 치료 떠나.</li>
	<li>Transfection의 12-24 h 후 transfected 샘플 중 하나를 아닌 페 컨트롤 중 하나에 Teb (최종 농도, 0.2-10 µmol)를 추가 합니다. 다른 두 개의 샘플 실험 컨트롤로 치료를 둡니다. 참고: Teb 재고 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide에 녹아 50 m m) 세포 배양 매체, DMEM, 또는 실험적인 매개 변수에 따라 경작된 한 세포에 추가 하기 전에 적절 한 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 희석 수 있습니다. 그러나, 수성 해결책에 있는 Teb의 낮은 가용성, 때문 매체; Teb의 높은 농도 가진 마스터 믹스를 준비 하지 않도록 대신, 원하는 농도 Teb 포함 된 신선한 매체와 완전 한 세포 배양 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 12-48 h Teb 치료 및 치료 세포 배양</li>
	<li>EGFP 를 사용 하 여 삽입 하는 경우 ( 그림 2) 형광 현미경 EGFP 식 분석. 그렇지 않으면, immunoblotting 분석 결과 대 한 셀을 수확.<ol>
<li>Immunoblotting 분석 결과 대 한 차가운 PBS로 두 번 셀 린스 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 밖으로 그들을 긁어.</li>
		<li>셀, 말뚝에 대 한 21000 x g 18-25 ° C (RT)에서 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 수확 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>PBS를 완전히 삭제 후 차가운 포유류 단백질 추출 시 약 0.5 mL을 추가 (M-당), 프로 테아 제 억제 물 (프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 100의 5 µ L), 셀 60 mm 접시에 교양 경우 펠 릿을 함께.</li>
		<li>다시 pipetting의 몇 라운드와 셀을 일시 중지 하 고 18-25 ° C (RT)에서 15 분 동안 정지 셀을 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 21000 x g에서 lysate 셀 회전</li>
		<li>Microcentrifuge 신선한 1.5 mL 튜브에 수성 상쾌한을 전송 합니다.</li>
		<li>상쾌한 immunoblotting, 적절 한 항 체와 다음 표준 프로토콜 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pEUI(+) 유전자 스위치의 게놈 통합 안정적인 HEK293 세포 라인의 세대
<ol><li>Transfection 시 약의 15-30 µ L를 사용 하 여 90mm 직경 셀 문화 접시에 50-60% 합칠 HEK293 세포에 있는 transgene로 순화 pEUI(+)의 5-10 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 500 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>Transfection, 후 성장 하 고 표현 하는 37 ° c.에 24-48 시간 (puromycin) 없이 비 선택적 문화 매체에서 puromycin 저항 유전자 제품 transfectants 허용</li>
	<li>Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. 문화 매체를 삭제 후 씻어 미리 데워 공영 (37 ° C)와 transfectants, 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 데워 진된 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확</li>
	<li>다시 미리 데워 진된 문화 매체 (37 ° C), 및 90 m m 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 10 mL 50 mL에는 transfectants를 일시 중단 합니다. 37 ° C에서 셀 puromycin 치료 전에 50-60 %confluency 문화 (일반적으로,이 약 24-48 시간 걸립니다).</li>
	<li>배양 세포 배양 매체 3 µ g/mL puromycin 3-4 주 보충에서 37 ° C에서 transfectants. 선택 기간 동안 세포 배양 매체 선택의 압력을 유지 하기 위해 2-3 일 마다 puromycin (3 µ g/mL)에 포함 된 변경. 셀이 될 때 완전히 confluent, 절차 단계 3.3-3.4 puromycin 포함 된 문화 매체에 따라 그들을 분할. 필요 하지 않은 경우 문화 매체에 나머지 셀을 삭제 합니다. 참고: Puromycin 선택 조건은 특정 종류에 대 한 실험적으로 설정할 수 있어야 합니다. 우리 세포 배양 매체;에 puromycin의 3 µ g/mL을 사용 이것은 비 페 HEK293 세포 죽음을 유도 하기에 충분 했다.</li>
	<li>복제 실린더를 사용 하 여 개별 식민지에서 세포를 수확 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>세포 배양 매체를 버리십시오. 미리 데워 진된 (37 ° C) 떠 있는 세포를 제거 하는 PBS로 두번 접시를 헹 구 십시오.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 개별 식민지 복제 실린더를 설정 합니다.</li>
		<li>각 실린더에 0.35 %trypsin / EDTA의 0.2 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>세포를 분리, 하 서 다음 실린더에 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체의 몇 방울을 추가 때까지 1 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
		<li>문화 매체의 2 mL 및 1 µ g/mL에 각 잘 puromycin 6 잘 플레이트의 개별 우물에 각 실린더에서 세포를 전송. 참고: 셀 될 때 confluent, 문화를 확장. 이제 clone(s)는 설정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 매체 1 µ g/mL puromycin의 보충에 개별 복제를 유지 관리 합니다.</li>
	<li>개별 식민지 immunoblotting와 transgene의 식 수준을 분석 하 여 24 h. 테스트에 대 한 Teb 치료 (최종 농도, 10 µ M)에 그들의 감도 Teb에 클론의 응답 속도 테스트 하 여 확인 합니다. 원하는 복제 (클론)를 선택 합니다. transgene의 유도 수준을 분석 하기 전에 Teb 취급 하 고 37 ° C에서 12-48 시간 배양에서 치료 샘플을 배양. 식 수준 transgene immunoblotting, 단계 2.5.1-2.5.7에서에서 절차를 통해 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. Teb의 고갈
<ol><li>Teb 무료 매체 Teb 포함 세포 배양 매체를 대체 하 여 Teb 자극을 끄다. 참고: 먼저 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 없이 성장 매체를 대체 하기 위하여 추천 된다. 잔여 Teb 플라스틱 접시에 집착에 나타나고는 transgene의 강한 배경 식을 이끌어내는 것입니다. 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 전에 수확된 세포 배양 또는 PBS로 여러 번 씻어.<ol>
<li>Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. Teb 문화 매체를 포함, 삭제 후 미리 데워 공영 (37 ° C)와 두 번 Teb 자극 세포를 씻어, 0.25 %trypsin / EDTA의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확</li>
		<li>다시 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (37 ° C), 및 3 개의 60mm 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 5 mL 50 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 각각 24, 48, 및 72 h 37 ° C에서 세포 문화.</li>
		<li>다른 시간 지점에서 세포를 수확 하 고 immunoblotting를 사용 하 여 식 수준 있는 transgene의 측정. 참고: 이러한 실험 조건 transgene 식 Teb 무료 문화 매체 (그림 3)에서 세포의 탐지 약 3 일 후 문화 되었다. 식 수준 transgene immunoblotting 단계 2.5.1-2.5.7 당에 의해 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.

이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하...

여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10를 포함 하 여 몇 가지 작은 분자 inducers 악용 되어 그리고 ecdysone11,12,,1314. 일반적으로 이러한 시스템 2 개 또는 3 개의 개별 식 단위를 포함 하는 두 개 이상의 플라스 미드, 하나 또는 두 작성 transcriptional 활동을 얻기 위해 작은 분자 유도 규제 요소 (유도 플라스 미드) 그리고 또 다른 플라스 미드 (effector 플라스 미드) 유도 바인딩된 규제 요소에의 액세스를 허용 하는 규제 DNA 영역 통제 transgene를 포함. 이진 시스템의 주요 단점은 대상 셀에 두 개의 벡터 (유도 및 effector)의 수 반하는 도입 필요. 과도 transgene 식 실험에서 두 개의 플라스 미드의 동시 transfection 필연적으로 생산 하지는 유도 또는 이펙터, 페 단독 또는 공동 하지 똑같이 페 셀의 인구. 또한, 이진 시스템 2 라운드는 어렵고 힘 드는 안정 세포 선 확립 항생제 선택의 필요 합니다. 따라서, transgene 식에 필요한 모든 구성 요소를 결합 하 고 단일 벡터에 규제의 단일 셀의 모든 필수 요소 부수적인 표현 보장 transgene 표현의 규제에 대 한 허용을 이상적인 것 통해 작은 분자 inducers와 치료.
이진 진 스위치의 단점을 극복 하기 위해 우리 최근 개발 단 수 유전자 스위치는 초파리 melanogaster EcR 기반 유전자 유도할 수 있는 시스템15를 사용 하 여. Ecdysone 중재 유전자 발현 DNA 규제 요소3,11EcR의 바인딩 차례로 유도 EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer를 묶을 때. 척 추가 있는 retinoid X 수용 체 (RXR), 곤충, USP의 ortholog EcR 활성 transcriptional 활성 제16를 보충 한다. 따라서, 척추 세포 또는 조직에 있는 transgene의 타겟된 식 EcR과 RXR 해야 공동 표현한 동시에 ecdysone 또는 그 촉진제에 의해 자극 되 고 전에. 때문에 EcR 기반 유전자 스위치의 heterodimeric 기능 생 RXR 수준, Padidam 외에의해 영향을 받을 수 있습니다. EcR DNA 바인딩 및 활성화 도메인 분리 GAL4 DNA 바인딩, 포진 심 플렉스 바이러스 단백질 vmw65 교체 (VP16) 활성화 도메인 다음 생 RXR 응답 되었고 한 homodimer 형성 EcR의 ligand 바인딩 도메인에 융합 에 transcriptional 활동17를 얻을. EcR 기반 유전자 스위치는 homodimer 형성 ecdysone 주 작동 근, Teb16의 부재에 cytosol에는 GvEcR와 함께 최소한의 VP16 활성화 도메인의 구성 공상 단백질을 구성 하 여 더욱 향상 되었다 18. Teb에 바인딩하여는 GvEcR 변경의 subcellular 지 방화는 cytosol에서 핵 zebrafish E1b 10 탠덤와 함께 최소한의 발기인의 구성 하이브리드 발기인 반복 상류 활성화 순서 (UASs) 시작을 인식 하는 16대상 유전자의 전사
16,18전환 이전에 보고 된 EcR 기반 유전자를 단순화 하기 위해, 우리는 자극 transgene 식에 대 한 모든 필수 요소를 갖춘 다음 지정 된 단일 벡터에 결합 시스템의 바이너리 기능 새로 생성 된 벡터, pEUI(+) (은행 승인 번호: KP123436, 그림 1A)15. GvEcR 드라이버 (이 드라이버)에 응답 하는 이펙터 EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 인식 시퀀스 (그림 1B) 10 탠덤 UAS E1b 최소한의 발기인을 여러 복제 사이트 (MCS)에 의해 다음 다음 반복 구성 됩니다. 페의 선택을 촉진 하는 또한, 세포는 SV40 발기인 기반 puromycin N-아 세 틸-안정적인 셀 라인 (그림 1)를 유지 하기 위해 드라이버와 이펙터 영역 사이 전이 (PAC) 효소 유전자 배치 했다.
우리는 transgene 식 pEUI(+)를 사용 하 여의 과도 하 고 안정적인 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 ecdysone 주 작동 근으로 Teb의 성공적인 사용에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>The patent license was transferred to TransLab Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein&lt;br/&gt; Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.

GvEcR 기반 단일 유전자 스위치 그림 1A에서 묘사 된다. PEUI(+) 벡터 Teb와 치료에 의해 규제 transgene 식을 위해 최적화 되었다. PEUI(+) 이펙터 지역 한 10xUAS는 E1b MCS EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 제한 효소 인식 사이트를 포함 하 여 최소한의 발기인 따라 구성 되어 있습니다. SV40 많은 신호는 MCS (그림 1B) 뒤에 추가 되었습니다. PAC...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K 조회수.  Chungnam National University. 여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

비디오: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

연구

유전학

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

발생학

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

면역학 및 감염병학

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

생체공학

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

생물학

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www.jove.com/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...