이 방법은 지배적 인 부정적인 버전을 뒤집음으로써 관심 유전자의 조건부 및 일시적인 비활성화가 필요한 다양한 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 활성에서 부분 절제만 허용하므로 잔류 내인성 발현을 보존한다는 것입니다. 비록, 여기서 우리는 다원어질 어셈블리에서 작동하는 RB 단백질의 상태를 기술하더라도, 이 방법론은 또한 단황 단백질에 적용될 수 있습니다.
우리의 실험실 기술자이자 원고의 공동 저자인 Umesh Pyakurel이 절차를 시연합니다. 시작하려면, NIH3T3 세포를 성장, 공급 업체의 사양에 따라, 에서 섭씨 37 섭씨 5% CO2, 포함 권장 세포 배양 배지를 사용하여 10% 태아 소 혈청. pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 세포를 결합하기 위해, 먼저 지질 계 형 경질 시약의 2 ~4 마이크로리터를 잘 혼합하고, 15 밀리리터 튜브에서 잘 당 불완전한 DMEM의 1 밀리리터를 혼합하고, 실내 온도에서 5 분 동안 배양한다.
이 트랜스펙트 시약의 DMEM 믹스에 잘 당 2 ~ 3 마이크로 그램의 플라즈마 DNA를 추가합니다. 실온에서 20분간 혼합하고 배양하세요. NIH3T3 세포를 가진 6웰 플레이트의 각 웰에 DNA와 DMEM에 있는 transfection 시약을 포함하는 혼합의 1 밀리리터를 추가합니다.
3~4시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 CO2를 받은 배양 후 완전한 배지 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 각 우물에 독시사이클린 스톡 2 마이크로리터를 추가하고 접시를 플러스 독시사이클린으로 표시합니다. 5%의 CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다.
예약되지 않은 세포 증식을 촉진하는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 구조의 기능을 평가하기 위해 DMEM의 배양 HEI-OC1 세포는 허용 조건하에서 10%의 FBS를 함유하고 있습니다. 세포 증식 연구의 경우 세포 카운터를 사용하여 HEI-OC1 세포를 계산합니다. 플레이트 10, 000 HEI-OC1 세포는 각각 200 마이크로리터의 96웰 플레이트에 잘 어울리라.
밤에 세포를 33도에서 5 %의 CO2로 배양하십시오. 유전자 발현을 유도하려면, 전염된 HEI-OC1 세포의 하위 집합에 독시사이클린의 밀리리터 당 1 마이크로그램을 추가한다. 마이너스-독시사이클린및 비감염된 HEI-OC1 세포로 표시된 다른 서브세트를 대조군으로 사용하고, 세포를 섭씨 33도로 10%CO2로 배양한다.
세포 증식을 평가하기 위해, 48 시간 형질 후, 세포 배양 배지를 제거하고 마이크로 플레이트의 각 웰에 세포 증식 키트에서 1x 염료 결합 용액100 마이크로 리터를 추가합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르고 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션을 사용하세요. 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 각 샘플의 형광 강도를 측정합니다.
면역 세포 화학을 사용하여 세포 증식을 추가로 평가하기 위해, DMEM의 12웰 플레이트의 각 웰에 놓인 커버 유리에 HEI-OC1 세포를 플레이트. 섭씨 33도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 두 개의 우물에서 세포에 대한 균질을 한 다음 NIH3T3 세포와 함께 수행되는 것과 마찬가지로 독시사이클린 치료를 수행한다.
비감염되지 않은 것을 컨트롤로 잘 사용하십시오. Ki-67 라벨링에 대한 세포를 처리하려면 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 수정하십시오. 그 후, 얼음 차가운 PBS로 각각 5 분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.
PBS에 0.25%의 니언 세제를 넣고 10분 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 세 번 세척을 반복합니다. 세포를 차단하기 위해 10% 혈청을 사용합니다.
실온에서 1 시간 동안 가습 챔버에서. Ki-67 1차 항체의 마이크로리터 500기를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 셀을 세 번 다시 씻으십시오.
이차 항체의 1 밀리리터를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양하십시오. 이차 항체 용액을 제거한 후, 어둠 속에서 PBS에서 5분 동안 세포를 다시 세 번 씻는다. HEI-OC1 세포를 판로이드인으로 표시하려면 실온에서 30분 동안 1:200 판로이드에 인큐베이션하십시오.
세포 핵을 레이블을 지정하려면 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 5 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 유전자 마우스의 전달 후, 원고에 기재된 바와 같이 CBRb1 융합 영역에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 새끼를 유전자형으로 한다. 실험적인 DN-CBRb 마우스를 생성하기 위해 로사-CAG-rtTA 및 테트레사이클린 유도선에 성인용 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 마우스를 사육하고, 원고에 설명된 바와 같이 자손을 유전자형으로 한다.
NIH3T3는 내인성 RB1 단백질을 발현하지 않으므로 여기서 볼 수 있는 견고한 RB1 발현은 Dox의 존재에 대한 유전자 유도에 기인하지만, 그 부재는 아니지만 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1 구분의 효율적인 활성화를 확인한다. 대조적으로, HEK293 세포는 내인성 RB1 발현을 갖는다. 독시사이클린의 추가는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 활성화 및 RB1 다운-규제로 이어졌습니다.
RB1 발현은 독시사이클린이 미디어에서 제거된 후 21시간 후에 재개되었다. 동일한 벡터와 cotrans감염된 HEI-OC1 세포는 독시사이클린으로 치료되지 않은 전과 비교하여 독시사이클린 치료를 따르는 세포 수의 겸손하지만 유의한 증가를 표시하고, 비감염된 세포. 시상 혼성화에서 형광은 마우스에서 TetO-DN-CB-myc6-RB1 트랜스진의 게놈 삽입을 확인하였다.
대조군에 비해 3일 동안 독시사이클린으로 처리된 형질전환마우스의 달팽이관에서 총 RB1 단백질 발현이 초기에 증가하였다. 그러나, 7일 및 10일 동안 독소사이클린으로 처리된 군에서 RB1 발현의 현저한 감소가 관찰되었다. 분석된 조직에 관계없이, RB1 단백질의 현저한 감소는 독소세포로 처리되었지만 대조군에서는 관찰되지 않아 TetO-DN-CB-myc6-RB1 생성물의 효율을 확인하였다.
이 절차를 시도하는 동안, 트랜스진의 각 코딩 요소가 서로 프레임에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 보고서에 설명된 카테신 B와 망막 모세포종의 코딩 영역이 우연히 프레임 밖으로 연결된경우 의도된 융합 단백질을 산출하지 못할 것입니다. 따라서, DNA 서열 검증은 단세포 마우스 배아에 전균유전자를 주입하기 전에 이루어져야 한다.
이 절차에 따라, 유비쿼터스 CAG 프로모터는 세포의 특정 방식으로 유전자 기능을 연구하기 위해 특정 프로모터로 대체 될 수있다.
