우리이 프로토콜 기반으로 원래 연구에 그들의 공헌에 대 한 박사 A. 야 코 보, 닥터 제이 Salvi, 그리고 A. Petelski 감사 합니다. 우리 또한 기술 지원 및 축산에 대 한 제이 라마와 W. Makmura을 감사합니다. 우리 R01DC015530, 로버트 슨 치료 개발 기금, 그리고 자금 카루소 가족 재단 NIDCD 부여 NIDCD 훈련 그랜트 T32 DC009975, 인정 합니다. 마지막으로, 우리는 하 워드 휴즈 의학 연구소, 박사 Hudspeth 탐정은 지원을 인정 합니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 록펠러 대학와 남부 캘리포니아의 대학 승인 있다.
1. (선택 사항) 준비 콜라겐의 나 Mouse-tail 힘 줄에서 솔루션
참고: 콜라겐 나 솔루션 상업적으로 사용할 수 있습니다. 젤 준비에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
<ol><li>5-10 젊은 성인 (3-5 주 이전) 마우스 프로토콜 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회16에 의해 승인에 따라 이산화탄소와 어떤 강포한 유형 긴장의 안락사 꼬리를 수집 하 고 실 온에서 4 h의 최소 70% 에탄올에 잠수 하 여 소독. 참고: 그것은 과도 한 조직 탈수에 결과 힘 줄 추출 과정을 방해 이상 48 h에 대 한 보육은 피해 야 한다.</li>
	<li>메스 칼 날 경도 컷을 소개 하 고 집게로 전체 피부를 제거 하 여 각 꼬리에서 피부를 제거 합니다. 100 mm 페 트리 접시와 10 mm 세그먼트로 그들을 잘라 깨끗 한 70% 에탄올으로 가득 차 피부 꼬리를 전송 합니다. 참고: 조작 하기 어려운 꼬리의 가장 얇은 부분을 삭제 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 페 트리 접시의 바닥에 꼬리의 각 세그먼트를 보안 하 고 좋은 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여 한 번에 하나의 꼬리에서 힘 줄을 추출. 개별 힘 줄 섬유는 최소한의 저항으로 등장 한다. 참고: 오래 된, 둔 #5 포 셉이이 단계에 대 한 잘 작동합니다.</li>
	<li>100 mL의 멸 균, 분자 급 물에 아세트산의 (볼륨)에 의해 0.1% 솔루션을 준비 하 고 살 균 100 mm 페 트리 접시에 해당 솔루션의 10 mL를 추가. 페 트리 접시에 힘 줄을 전송 하 고 콜라겐 변성을 실 온에서 1 h 나 두고.</li>
	<li>무딘, 곡선 팁 살 균 메스 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 1-2 m m 조각으로 힘 줄을 말하다. 살 균 50 mL 튜브에 다진된 힘 줄을 전송 하 고 0.1% 아세트산 50 mL에 볼륨을가지고 추가 합니다. 참고: 4 사용 또는 5 꼬리는 콜라겐을 달성 하기 위해 산의 각 50 ml 나 2.0-2.5 mg/mL의 농도.</li>
	<li>콜라겐을 냉장 나 완전 한 단백질 변성을 촉진 하기 위하여 48 h의 최소 4 ° C에서 솔루션. 탁상 소용돌이와 소용돌이 하루에 두 번 1 분에 대 한 최대 속도를 설정합니다.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 솔루션의 단백질 농도 측정, 조정 하는 콜라겐 나 4 ° c.에 초 산, 그리고 저장소의 0.1% 솔루션을 추가 하 여 2.0-2.5 mg/ml 농도 참고: 콜라겐 나 솔루션 1 ~ 2 년 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 콜라겐을 원심 나 2000 x g 1 h 4 ° C와 반투명 최고 분수 (약 절반 볼륨의), 광학 투명 콜라겐을 달성 하기 위해 제 4에 젤 사용에 대 한 솔루션.</li>
</ol>2입니다. Vestibular 및 청각 기관의 해 부
<ol><li>관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회16에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 이산화탄소와 어떤 긴장 든 지의 임신 쥐 안락사 추출 하 고 배아를 목을 벨. 참고: Lfng 크리스챤T2/tdTomato 마우스 지원 4-hydroxytamoxifen17에 노출 시 세포의 영구 라벨 수 있도록 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 작업 표면과 해 부 악기, #5 집게와 머리 칼18의 2 개 쌍을 포함 하 여 70% 에탄올과 그들을 청소 하 여 소독.</li>
	<li>살 균 메스 칼 날 경도 컷을 소개 하거나 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽에 각 머리 분할. 내부 귀19를 포함 하는 측 뼈를 추출 하 고 차가운 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 60 mm 페 트리 접시에 15 mL에 넣어. 얼음에 접시를 유지. 참고: 배아 단계에서 E13.5 E18.5의 범위에서 성공적으로 사용 되었습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 부드럽게 포함 30 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 흔들어 내 귀를 씻고 차가운 HBSS 및 교체는 HBSS 3 ~ 4 번. 얼음에 튜브를 유지. 참고: 이 단계는 조직 문화의 가능한 오염 제한 하 고 신속 하 게 조직의 저하와 세포 죽음을 방지 하는 4 ° C에 온도 가져온다.</li>
	<li>잘 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여, 내부 귀 측 뼈에서 하 고 차가운 HBSS 가득 60 mm 페 트리 접시에 귀, 3 또는 4 한 번에 전송 합니다.</li>
	<li>Vestibular 감각 기관 해 부.<ol>
<li>최대 귀 중간 측 방향 하 고는 utricle 찾습니다. #5 집게의 두 쌍, vestibular 장기 주변 연골을 제거 합니다. 그림 1에서 같이 부드럽게 vestibular 신경은 utricle 및 saccule, 반원의 운하 사이 연결을 끊다. 부드럽게 당겨는 utricle와 귀에서 우수 하 고 수평 반원의 운하의 첨부 ampullae. 참고: 이 메서드는 단계 E16.5-E18.5의 내 귀에 사용할 수 있습니다. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.</li>
	</ol>
</li>
	<li>달팽이 관을 해 부.<ol>
<li>집게를 #5 두 켤레와 청각 기관 주변 연골 조직을 제거 합니다. 그림 1에서 보듯이 부드럽게 사이 인공 와우는 saccule 연결을 끊다. 참고: 위한 단계 E13.5-E14.5, 내부를 치료 하 여 해 부 이전 연골을 부드럽게 귀 0.25% 콜라와 나 실 온에서 5 분에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.</li>
	</ol>
</li>
	<li>넓은 nonstick 팁 장착 200 µ L 피펫으로 사용 하 여, 성장 매체 구성 된 DMEM/F12 33 m m Dglucose, 19 m m 탄산, 15 m m 4(2hydroxyethyl)-보충으로 가득 30 mm 페 트리 접시에 utricles와 cochleae를 전송 1piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1mm 글루타민, 1mm 니코틴, 20 mg/L와 표 피 성장 인자, 20 mg/L 섬유 아 세포 성장 인자, 10 mg/L 인슐린, 5.5 mg/L 올려진다, 및 5 µ g/L 나트륨 selenite.</li>
	<li>해 부 동안에 소개 하는 상피에 상처의 치유를 허용 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 최대 3 h utricle 준비 유지 합니다. 달팽이 관 준비 해 부 후 콜라겐 젤 10 분에 전송 한다. 참고: 얼음 처럼 차가운 HBSS에서 해 부를 수행 하기 때문에 거기 아무 필요도 사전 37 ° c.에 성장 매체를 따뜻한</li>
</ol>3. (선택 사항) 콜라겐 조정 내가 Chondrocytes의 다양 한 농도 추가 하 여 강성을 젤
참고: Chondrocyte 격리 방법 Gosset 외 에서 수정 된 20
<ol><li>콜라의 1% 솔루션 준비 나 PBS와 저장소-80 ° c.에 100-200 µ L aliquots x 살 균 1 필요할 때 얼음에 서 리 없애다, 여러 freeze-thaw 주기를 피하.</li>
	<li>연골의 조각을 수집 하기 좋은 집게를 사용 10-12 귀에서 vestibular 및 청각 기관의 해 부에서 남은. 연골에서 별도 결합 및 내가 조직. 30 mm 페 트리 접시에 연골을 전송 하 고 살 균 성장 매체의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>무딘 곡선된 팁 살 균 메스 블레이드 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 연골 조각 길이 약 0.5 m m를 달성 하기 위해 조직 말하다.</li>
	<li>콜라를 추가 0.25%의 마지막 효소 농도 달성 하기 위해 연골과 매체를. 37 ° C와 5% 이산화탄소 기름에서 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송. 피펫으로 연골의 해리 조각과 솔루션에서 구별할 수 더 이상 없을 때까지 적극적으로 1000 µ L 피펫으로 매 20 분을 사용 하 여 다음 추가 20 분 동안 품 어. 참고: Utricle 준비 경우 chondrocyte 절연 2.9; 단계 수행할 수 있습니다. 그것은 걸립니다 약 2 시간 (pipetting 라운드 3-4).</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 살 균 1 x PBS와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 10 mL에 셀 resuspend. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 셀을 두 번; 세척 하는 것이 중요 모든 나머지 콜라 나 내가 젤 콜라겐을 다이제스트 것입니다.</li>
	<li>200 µ L 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿을 부드럽게 resuspend을 피펫으로 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 사용 하기 전에 얼음에 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>젤 강성을 높이기 위해 추가 chondrocytes 무력화 콜라겐 젤 솔루션 (제 1 항) 하 고 급속 하 게 혼합 응고 전에 젤을 통해 셀을 배포. 참고: 탄성 계수는 콜라겐의 내가 젤 (강성 측정), chondrocytes 수와 선형 증가 추가11. 실험적 결정된 선형 함수 E 에 의해 관계를 설명 하는 206· = Nc + 15, 있는 E 파스칼 및 Nc 에서 탄성 계수는 수백만에서 chondrocytes 수입니다. 젤에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 강성 측정을 참조 하십시오 원래 제11.</li>
</ol>4. 장소 내가 젤 콜라겐에서 Vestibular 또는 청각 감각 기관
<ol><li>살 균 1.5 mL 튜브에 콜라겐 준비 나 페 놀 레드 pH 지시자, 0.34 M 수산화 나트륨의 133 µ L, 0.9 M 나트륨 중 탄산염의 70 µ L와 1 M HEPES의 40 µ L 10 x PBS의 160 µ L를 혼합 하 여 중 합 솔루션. 얼음에 튜브를 유지. 참고: 이 제조 법 합 솔루션을 콜라겐 젤, 하지만 필요에 따라 조정 될 수의 2 개 mL를 준비 하는 데 필요한을 제공 합니다.</li>
	<li>합 솔루션 및 콜라겐의 400 µ L의 믹스 100 µ L 나 부드럽게 위아래로 냉장된 1.5 mL 튜브에 pipetting으로 얼음에 솔루션. 젤 강성을 높이기 위해 chondrocytes 포함 된 성장 매체의 50 µ L을 추가 하 고 섹션 3에 설명 된 대로 부드럽게 혼합 합니다.</li>
	<li>중화 콜라겐의 500 µ L을 전송 나 솔루션 10 m m 유리 하단 삽입 냉장된 30 mm 페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 우물. 참고: 그것은 콜라겐의 신속 하 고 고르지 못한 중 합을 방지 하기 위해 얼음에 모든 시 약을 유지 하는 중요 한 나.</li>
	<li>신속 하 게 무력화 콜라겐을 cochleae 또는 utricles를 전송 나 솔루션 메 마른 머리 칼18 와 미세 집게의 쌍 그들의 원하는 위치에 장기 조정. 참고: 콜라겐 나 솔루션 탁 되면서 중 합 1-2 분 후 눈에 띄게 된다.</li>
	<li>조직 중심 솔루션은 생산 후 완전 한 중 합을 보장 하기 위해 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 페 트리 접시 또는 20 분 4-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 당 같은 매체의 500 µ L 당 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다. 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 유지 합니다. 원하는 경우, 성장 매체 10 µ M 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 세포 확산을 함께 보충. 참고: 원하는 경우 높은 FBS 농도 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 바이러스 주사 Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 문화에
<ol><li>얼음에 원하는 바이러스에 서 리 없애다과 0.05%의 최종 염료 농도 달성 하기 위해 0.5 mL 원뿔 튜브에서 trypan 블루 솔루션 믹스. 10-20 x 염료를 사용 하 여 바이러스의 실질적인 희석을 피하기 위해. 얼음에 계속. 참고: 아 데 노비 루스 serotype 5 작품을 최고의 adeno 관련 바이러스 Anc80 두 세포를 감염 시킬 수 있습니다 반면 utricle19에서 지 원하는 세포를 감염 하 고는 utricle에 달팽이 관21셀을 지원 하기 위한.</li>
	<li>해 부 현미경 쌍안경의 높은 배율에서 관찰 하는 동안 깨끗 한 고 운 집게 micropipette 끌어당기는 사람에 준비 유리 바늘의 팁을 휴식. 참고: 그것은 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 하는 것이 중요입니다. 9-12 m m 정강이로 바늘을 20-30 μ m 채용 적합합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 감각 기관 문화를 제거 합니다. microinjector에 바늘을 연결 하 고 염료 및 바이러스 혼합물의 2-3 µ L로 그것을 채우십시오. 해 부 현미경 눈 아래 그것을 관찰 하는 동안 바늘 감각 기관에 사전.</li>
	<li>부드럽게 3 차원 utricular 문화의 엽과 상피 층을 통해 바늘 팁 드라이브. 파란색 염료 채울 utricle ampullae의 충 치 때까지 바이러스 성 혼합물을 주사. 참고: 감각 기관에 쉽게 접근할 수 있기 때문에 10 m m 유리 하단 페 트리 접시 주사에 대 한 최적입니다.</li>
	<li>5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 참고: 녹색 또는 빨간색 형광 단백질을 바이러스 구문에서 사용 될 때 형광은 명백한 24 h 바이러스 성 변환 후.</li>
</ol>

<ol>
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B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin.">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li><li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+regulates+extension,+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct.">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li><li>Tada, M., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension:+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos.">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

중재 하십시오 성장 및 개발 하는 동안 내가 차별화 된 분자 신호5,6,7,8,,910광범위 하 게 공부. 그러나 Utricular 모델 시스템에서 얻은 증거는 세포 접합 및 Hippo 신호의 활성화를 통해 감지 기계적 신호 또한 중요 한 역할 이러한 프로세스...

대부분의 포유류 기관 개발 측면의 연구 생체 외에서 시스템에 의해 촉진 되었습니다. 두 가지 주요 방법을 지금 vestibular 감각 기관의 문화에 대 한 사용 된다: 부동성1 및 부착2 . 두 방법 모두 머리 세포 취약점3 및 재생1,4 체 외조사를 허용합니다. 또한, 노치5,6, Wnt7,8, 그리고 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)9,10 신호 계곡 내가의 발달 역할을 설립, 부분적으로, 생체 외에서 문화 감각 epithelia 통해. 그러나, 세포 성장과 분화 제어 됩니다, 뿐만 아니라 세포 외 매트릭스의 강성 morphogens 세포 연락처 등 물리적 및 기계적 신호를 통해 뿐만 아니라에 의해 신호 및 기계적 스트레칭 또는 긴축 통해. 이러한 기계적 자극의 역할 개발 내가 vivo에서 조사 도전 이다. 또한, 기존의 자유 부동 및 부착 문화 방법 등 연구 시험관에 대 한 적합 하지 않습니다. 여기 우리는 방법 설명 젤 나 콜라겐에서 3 차원 organotypic 문화에 대 한 다양 한 경직의. 이 방법은 주로 vestibular 및 인공 감각 기관의 비보에 아키텍처를 유지 하며 성장과 분화11기계적인 힘의 효과 조사
기계적 자극 신호 통로12,,1314,15, 마 등 다운스트림 분자 이벤트 활성화 알려져 있습니다 때문에 기계적 자극을 결합할 수 중요 하다 와 생화학 및 유전 조작. 여기에 설명 된 문화 방법 바이러스 중재 유전자 배달 허용 하 고 따라서 공부 기계 기도 하 고 분자 내가 개발11동안 신호를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>#10 Surgical Blades</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL large orifice pipette tips</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mm glass-bottom Petri dish</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 well plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;nbsp;mm Petri dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, chicken IgY fraction</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy scissors&amp;nbsp;</td><td>Zepf Medical Instruments</td><td>08-1201-10&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red pH indicator&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs&amp;nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP antibody</td><td>ChromoTek</td><td>&amp;nbsp;5F8</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop vortex&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

three-dimensional organotypic cultures of vestibular and auditory sensory organs

내가 감각 기관 포유류 실험적인 조작 및 광학 관측의 어려움 때문에 공부에 도전 하. 또한, 기존의 문화 기술을 허용 생화학 물결, 이러한 메서드는 내가 감각 기관의 발달 동안에 기계적인 힘 및 조직 경직 효과 공부 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 여기는 그대로 murine utricle 이러한 한계를 극복 하는 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화에 대 한 방법에 설명 합니다. 여기에 설명 된 3 차원 매트릭스 강성의 조정 위한 기술 조직의 성장 반대 탄성 력의 조작을 허용 합니다. 이 방법은 따라서 내가 개발 하는 동안 기계적인 힘의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다. 또한, 문화 유전자 바이러스 중재 배달, 이득 및 손실-의-기능 실험을 위해 사용 될 수 있는 허용 한다. 이 문화 메서드는 타고 난 세포를 유지 하 고 지 원하는 세포 vestibular 및 청각 감각 기관의 전통적인 2 차원 문화에 대 한 잠재적으로 우수한 대안 역할.

Vestibular 및 청각 감각 기관 배아 귀에서 교양 40 Pa 콜라겐에서 내가 젤 낮은 강성 미 발달 조건11을 흉내 낸 상대적으로 정상 차원 구조 (그림 1)를 유지 하 고 세포를 유지 하 고 셀 (그림 2 및 그림 3)를 지원합니다. 30% 이상 감소 셀 밀도 지원 하지만 (스튜던트 t-검정: n = 4, p < ...

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Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K 조회수.  Keck School of Medicine of the University of Southern California. Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.

비디오: Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

연구

신경과학

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

생물학

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

발생학

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

의학

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Harvest of Vestibular End-Organs under Physiologic Conditions during Labyrinthectomy

The living human inner ear is challenging to study because it is encased within dense otic capsule bone that limits access to biological tissue. Traditional temporal bone histopathology methods rely on lengthy, expensive decalcification protocols that take 9-10 months and reduce the types of tissue analysis possible due to RNA degradation. There is a critical need to develop methods to access fresh human inner ear tissue to better understand otologic diseases, such as M&#233;ni&#232;re's disease, at the cellular and molecular level. This paper describes a technique for the harvest of human vestibular end organs from a living donor under physiologic conditions. An individual with M&#233;ni&#232;re's disease and 'drops attacks' that were refractory to intratympanic gentamicin injection underwent labyrinthectomy. A traditional mastoidectomy was first performed, and the horizontal and superior semicircular canals (SCC) were identified. The mastoid cavity was filled with a balanced salt solution so that the labyrinth could be opened under more physiologic conditions to preserve cellular integrity. A zero-degree endoscope fit with a lens-cleaning sheath irrigation system was used to visualize the submerged mastoid cavity, and a 2 mm diamond burr was used to skeletonize and open the horizontal and superior SCCs, followed by the vestibule. The ampullae and portion of the canal ducts for the superior and lateral SCCs were harvested. The utricle was similarly harvested. Harvested tissue was immediately placed in an ice-cold buffer and then fixed for one hour in 4% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline (PBS). The tissue was rinsed several times in 1x PBS and stored for 48 h at 4 &#176;C. The tissue samples underwent immunostaining with a combination of primary antibodies against tenascin-C (Calyx), oncomodulin (streolar hair cells), calretinin (Calyx and Type II hair cells), synaptic vesicle protein 2 (efferent fibers and boutons), &#946;-tubulin 1 (Calyx and afferent boutons), followed by incubation with fluorophore-conjugated secondary antibodies. The tissue samples were then rinsed and mounted for confocal microscopy examination. Images revealed the presence of ampullar and macular hair cells and neural structures. This protocol demonstrates that it is possible to harvest intact, high-quality human inner ear tissue from living donors and may provide an important tool for the study of otologic disease.

Here, we describe a technique for harvesting human vestibular end-organs under physiologic conditions during labyrinthectomy and their analysis using immunostaining.

Labyrinthectomy 중 생리학적 조건 하에서 전정 말단 장기의 수확

The living human inner ear is challenging to study because it is encased within dense otic capsule bone that limits access to biological tissue. ...

쥐 달팽이관 유모 세포의 효율적인 In vitro 배양

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

저자 스포트라이트: 청각 연구를 위한 쥐 유모 세포 배양의 발전 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...