이 프로토콜은 각막 염증을 연구하기위한 훌륭한 모델이며 정상 및 병리학 적 조건에서 상처 치유에 기여하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 기저막을 침범하지 않고 정확하고 재현 가능한 상피 상처를 생성한다는 것입니다. 각막 상처의이 모델은 간단하고 신속하게 수행 할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Akowuah 왕자가 될 것입니다. 시작하려면 1 밀리리터의 멸균 식염수 또는 PBS에 10 밀리그램의 소듐 플루오레세인 염을 용해시켜 1 % 플루오레세인 용액을 준비하십시오. 다음으로, 마취를 위해 케타민 두 밀리리터, 자일라진 1 밀리리터, 멸균 PBS 7 밀리리터를 혼합하여 케타민-자일라진 칵테일 10 밀리리터를 준비하십시오.
8 내지 12주령의 C57 검정 6 야생형 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집음 후 페달 반사를 평가하여 마취 깊이를 평가하였다. 상피 각막 상처를 만들려면 마취 된 마우스를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 오른쪽 또는 왼쪽 눈만 상처 입히고 마우스에서 마우스로 이동할 때 상처받는 눈과 일관성을 유지하십시오.
엄지와 검지 손가락으로 눈꺼풀을 잡고 눈을 크게 뜨게하십시오. 그런 다음, 직경 두 밀리미터의 멸균 트레핀을 사용하여, 각막의 중심을 경계하고 트레핀을 부드럽게 돌리면 각막 상피에 인상을 남긴다. 과도한 압력을 가하지 마십시오, 이것은 각막 천공을 초래할 수 있습니다.
다음으로, 멸균된 무딘 골프 클럽 스푸드를 각막 표면으로부터 약 45도 각도로 유지하고, 스푸드를 사용하여 경계 영역 내에서 조심스럽고 지속적으로 긁어내어 상피를 탈조시킨다. 과도한 힘을 가하지 말고 필요한 경우 멸균 PBS를 사용하여 수분을 유지하십시오. 상처 폐쇄 및 재상피화를 모니터링하기 위해, 상처 표면에 1% 플루오레세인 용액 1 내지 1.5 마이크로리터를 피펫팅하고 청색 광원을 갖는 디지털 현미경을 사용하여 각막을 이미지화한다.
상처 후 특정 시간에 상처 입은 각막을 이미지화하십시오. 플루오레세인 용액의 첫 번째 분 이내에 이미지를 촬영하여 용액이 주변 상피로 퍼지는 것을 피하고, 이로 인해 상처 크기가 과대 평가 될 수 있습니다. 다음으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 상처 부위를 추적하고, 각 시점에서의 상처 부위를 0 시간에 원래의 상처 부위의 백분율로 표현한다.
각막 상처의 투과 전자 현미경 사진은 상피 기저막이 손상 후에도 손상되지 않았 음을 보여줍니다. 8 ~ 12 주 된 야생형 마우스에서 상처 폐쇄는 상처 후 24 시간 후에 완료됩니다. 상처에 대한 염증 반응은 사지에서의 세포 이미징을 특징으로합니다.
여기에 표시된 것은 혈관외 호중구를 가진 상처 입지 않은 각막의 사지 혈관 구조이며, 마모 후 30 시간 후에 혈관외 혈소판 및 호중구가있는 상처 입은 각막의 혈관 구조입니다. 이 프로토콜을 성공적으로 재현하려면 마우스의 각 범위에서 동일한 변형을 사용해야하며 설명 된대로 상처 크기와 깊이를 만들어야합니다.
