이 논문은 3차원, 다세포 장기 배양 모델 시스템에서 상처를 속이는 간단한 방법을 설명했다. 우리는 돼지 눈을 사용하여이 작업을 수행하지만, 당신이 눈에 익숙하지 않은 경우에도,이 분석 작업을 수행 할 수 있습니다. 개요로, 우리는 돼지 눈을 받고, 지구를 잘라, 상피와 스트로마의 약 3 분의 1을 통과하는 각막에 원형 상처를.
우리는 각막을 잘라, 한천 기지에 장착하고, 인큐베이터에이 구조를 넣어. 조직은 각막에 흉터를 만드는 채우기 위해 채울 것입니다. 성장 요인, 심지어 혈청을 추가 할 필요가 없습니다.
이것은 혈청이없는 미디어에서 이루어집니다. 이것은 각막에서 수행되지만, 일반적으로 섬유성 치유를위한 모델 시스템으로 사용될 수 있습니다. 흉터 를 만드는 동안 활성화 되는 셀 룰 러 경로의 많은 시스템 사이 유사.
생체 안전 후드에서 직선 가장자리 수술 블레이드를 사용하여 에탄올 청소 도마의 뚜껑에서 지구를 제거하고 각 눈에서 과도한 지방 조직을 제거하십시오. 청소된 글로브를 집게로 뒤로 잡고 PBS에서 즉시 눈을 담그고 10%의 요오드에 3회 빠르게 딥을, PBS에서 2회 빠르게 딥을 기록했습니다. 그런 다음 깨끗한 실험실 조직으로 눈을 감싸서 각막에 닿지 않고 팽팽한 각막 표면을 달성하기에 충분한 압력으로 감쌉합니다.
6mm 트레핀을 사용하여 각막 중앙의 전방 기질에서 상피를 관통하고 각막 전체를 통해 전체 두께의 상처를 입히지 않고, 감기를 깊게하기 위해 가벼운 압력을 가하면서 시계 방향으로 시계 반대 방향으로 180도 회전합니다. 상처가 집게로 들어 올릴 수 있을 만큼 깊을 때, 수술용 블레이드를 사용하여 상처 마진 내에서 전방 각막을 계속 들어 올리면서 전 세계에 플랩을 자른다. 플랩 전체가 제거되면 원형 상처가 각막 중앙에 있어야 합니다.
각막을 수확하기 위해 실험실 조직으로 눈을 파악하고 외과 블레이드를 사용하여 각막 가장자리에서 1밀리미터 떨어진 작은 절개를 하여 림푸스와 조직 수집을 포함합니다. 작고 날카로운 가위를 사용하여 전 세계의 절개를 계속하여 각막을 가로질러 밀리미터 의 마진을 유지하여 림을 선극에 유지합니다. 그런 다음 각막, 상처 쪽, 60 밀리미터 또는 PBS 1 밀리리터를 포함하는 100 밀리미터 접시를 놓습니다.
각막을 장착하려면 두 쌍의 집게를 사용하여 각막 상피 면을 최대 위로 잡고 멸균 이송 파이펫을 사용하여 컵이 가득 찰 때까지 각막에 따뜻한 천용액을 추가하십시오. 한천이 굳어진 후, 각막을 새로운 60mm 플레이트 에 조심스럽게 놓고 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 그런 다음 각막의 각 접시에 각막분리기를 37°C의 세포 배양인 인큐베이터에서 공기-액체 인터페이스에 유지하며, 1회 1방울의 보충혈청 이음새를 사용하여 각막 표면을 습윤하여 소화된 티슈에 보관한다.
유전자 녹다운의 경우, 작은 간섭 또는 siRNa의 5 마이크로리터를 50 마이크로리터의 최소 필수 중간 및 2개의 미약 시약과 혼합합니다. 각막 당 감소 된 혈청 매체의 50 마이크로 리터. 5분 후, 두 혼합물을 함께 섞고 각 siRNA 혼합물에 200마이크로리터의 최소 혈청 최소 배지를 첨가한다.
그런 다음 siRNA 솔루션이 각 상처에 현명하게 떨어뜨립니다. 그런 다음 각막을 인큐베이터에 넣습니다. 3시간 후 각 접시에 배지를 사용하여 각 접시표면에서 siRNA를 세척하고 각 접시의 조건부 배지를 신선한 보충 세럼 프리 배지와 항생제로 대체합니다.
그런 다음 각막 배양을 세포 배양 배양인 인큐베이터로 되돌리고 2주 동안 배양합니다. 상처 후 6 시간, 각막 상피는 결석. 상처가 난 지 6일 후, 상피가 다시 커집니다.
알파 부드러운 근육 액틴으로 염색하는 형광 아미노산은 전방에서 후방 스트로마에 이르기까지 상처 마진을 따라 활성 심섬유 아세포의 그라데이션을 보여줍니다. 알파 스무스 근육 액틴을 위한 면역-히스토케미칼 염색은 상처입은 알파 스무스 근육 액틴 단백질 발현의 극적인 증가와 대조군 siRNA 각막을 드러낸다. 상처없이 표적 단백질 siRNA 치료, 상처받은 각막에 비해.
유사하게, fibronectin 엑스트라 도메인 A는 상처받지 않은 각막을 치료하고 부상당한 각막을 치료한 진각막에 비해 siRNA에서 강화된다. 표적 단백질의 성공적인 노크를 시연. 또한, 대상 단백질을 비구체적으로 표적으로 하는 독소로 상처받은 각막의 치료는 재상피화를 방지하고 질적 세포 사멸, 무질서한 매트릭스 및 기질 진공 부올레를 초래하여 독소가 분석된 농도에서 치유를 촉진하지 않는다는 것을 시사한다.
결론적으로,이 절차를 시도하는 동안 절단하는 동안 조직에 평행 블레이드를 유지하는 것이 중요합니다, 그래서 그것은 지구를 관통하지 않습니다. 화학 적 화상 이나 상피 긁힌 자국을 포함 하 여 이 분석으로 다른 상처 기법 사용할 수 있습니다. 또한 약물 독성 검사에 사용할 수 있어 상피가 치유되는지, 어떤 속도로 치유되는지 확인할 수 있다.
이것은 생체 내 상처 치유 연구를 선행할 수 있는 비용 절감 전 생체, 장기 배양 모형 시스템입니다.
