이 방법은 박테리아, 혈액 세포 및 내피 세포 안대기 근육 사이의 상호 작용과 같은 필드를 통해 감염 성 내막염 및 병영 사진의 병인에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 이식편이 표준화된 유량 조건에서 박테리아, 혈소판 및 단백질과 같은 다양한 표적과의 상호 상호 작용에 직접 적으로 노출될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 특정 조직의 높은 감염성을 구동 중요한 분자 상호 작용 과 요인을 해명 할 수 있기 때문에, 감염 성 내막염의 우리의 치료로 확장.
이 방법은 식물 형성의 병인에 대한 통찰력을 제공합니다. 그것은 또한 혈관 투과성, 세포 이동성 및 유전자 세포 발현을 조사하는 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 프로토콜을 시작하려면, 이전에 준비된 조직 생검을 직경 10밀리미터, 현미경 슬라이드와 8mm 원형 천공 사이의 동일한 두께, 그리고 내부 표면이 위로 향하는 고무 개스킷을 배치하여 세균 현탁액에 접촉한다.
홀더에 놓이면서 조직 이식 방향에 집중하십시오. 조직의 내부 표면이 이미 혈류 면에 노출되어 실험 매체에 연락하십시오. 다음으로, 챔버의 하단 금속 프레임에 내장 된 개스킷 시트에 조직과 홀더를 삽입합니다.
이전에 삽입된 조직 홀더를 사용하여 해당 개스킷 시트를 챔버 의 바닥에 부착합니다. 그런 다음 8 개의 나사와 나사 너트로 챔버 전체를 장착하십시오. 캘리퍼 또는 눈금자를 사용하여 챔버 높이가 접목 전반에 걸쳐 항상 동일한지 확인합니다.
다음으로 흐름 챔버를 연동 펌프와 연결합니다. 그런 다음 400 밀리리터 유체 저장소를 튜브와 연결합니다. 100밀리리터 서스펜션을 10밀리리터 현탁액으로 10밀리리터 서스펜션으로 10밀리리터 서스펜션을 10개에 7개의 형광라벨이 부착된 콜로니 성형 유닛에 인산염 완충식염에 있는 유닛은 평방 센티미터당 3개의 다이닝의 깎아지른 듯한 응력과 연골 펌프와 세균 저수지를 사용하여 1시간 동안 분당 4밀리리터의 유량으로 응모합니다.
동일한 수집 저장소를 사용하여 100 밀리리터 세균 현탁액을 지속적으로 재순환합니다. 관류 후 챔버를 분해하여 접목을 방출합니다. 3 분 동안 궤도 셰이커를 사용하여 12 웰 플레이트에 PBS의 4 밀리리터로 티슈 조각을 두 번 세척합니다.
그런 다음 직경이 작은 피부 생검 펀치를 사용하여 이식편의 내부 부분을 잘라냅니다. 각 조직 생검을 멸균 0.9%의 염화나트륨 1밀리리터를 함유한 별도의 14밀리리터 튜브에 넣습니다. 초음파 욕조를 사용하여 조직에서 박테리아를 10 분 동안 분리하십시오.
14 밀리리터 튜브를 멸균 0.9%의 염화 나트륨으로 제조하여 초음파 처리 후 얻어진 세균 현탁액의 직렬 희석을 만듭니다. 튜브 번호 2에 레이블을 지정합니다. 초기 세균 현탁액의 직렬 희석을 위해 멸균 0.9%의 염화나트륨 10밀리리터로 14밀리리터 튜브 3개에 제조하여 초기 세균 현탁액의 직렬 희석을 위한 증혈 실험에 착수한다.
튜브 번호 3, 4 번 및 5 번 라벨. 다음으로, 3개의 천판을 고정, 세균 관류용, PBS의 관류 제어를 위한 플레이트, 관류에 사용되는 초기 세균 현탁액에 대한 세 번째 플레이트. 조직 실험을 위해 플레이트당 3개의 섹터를 다음 방식으로 라벨:10-1, 10-3 및 10-4.
세균 내의 식민지 형성 단위의 수를 계산하려면 플레이트를 다음과 같이 레이블: 10-1, 10-3, 10-5, 및 10-7. 조직 생검을 함유하는 튜브를 각각 15초 동안 소용돌이치며 연쇄 희석을 합니다. 직렬 희석을 준비하기 위해 튜브 넘버 원 1의 마이크로리터를 튜브 넘버 2로 옮기고 튜브를 소용돌이어 용액을 철저히 혼합한다.
튜브 번호 1과 2 번의 내용물 100 마이크로리터를 해당 섹터에 확산, 10-1 및 10-3 용하 판의. 그런 다음 10 개의 마이크로 리터를 섹터 10 4에 2 번 전파했습니다. 이 단계를 4번 반복하여 각 10마이크로리터의 각 부피에서 4개의 별도 성장을 얻습니다.
초기 배양의 직렬 희석을 준비하기 위해 먼저 희석을 15초 동안 소용돌이치고 100마이크로리터의 세균현탁액을 튜브 번호 3로 옮기고, 소용돌이에 의해 적극적으로 섞는다. 튜브 번호 3의 마이크로 리터 100 마이크로 리터를 튜브 번호 4에 추가하고 다시 섞습니다. 튜브 번호 4에서 튜브 번호 5에 대한 절차를 반복합니다.
튜브 3번, 4번, 5번, 표지된 초기 배양물의 내용물 100개, 피의 한천판10-3, 10-5, 10-7, 10-1을 각각 계열한다. 라미나르 후드 아래에 혈액 식천판을 두어 세균 스프레드를 공기 건조시 10분 간 드립니다. 그 후, 하룻밤 잠복에 대한 37 섭씨에 접시를 배치합니다.
하룻밤 잠복 후, CfU의 수를 얻기 위해 세균 성 식민지를 계산합니다. 깎아지른 듯한 스트레스 조건 하에서, 다양한 이식 조직에 걸쳐 유사한 세균 부착은 포도상 구균과 포도상 구균 표피증 감염 둘 다를 위해 관찰되었습니다. 절차에 따라, 연쇄상 구균 sanguinis는 소 경정맥 벽에 대한 준수의 상당한 감소를 표시, 소 심낭 패치에 비해.
세균의 3종을 비교할 때, 연쇄상 구균 sanguinis는 포도상 구균 과 포도상 구균 표피증과 관련하여 소 경정맥 벽에 상당히 낮은 접착력을 제시합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 같은 머리의 올바른 조직을 준비한 것을 기억하는 것이 중요합니다. 모든 실험 표본에서 유사한 조건을 보장하고 다양한 실험 시리즈 간의 데이터 변동성을 최소화합니다.
개발 후, 이 기술은 연구원이 의료 상태에 가까운 완전한 복잡성을 구축하기 위해 다른 요소로 체외 모델 접근 방식을 풍부하게함으로써 단계별로 복잡한 장애 시스템을 탐구 할 수 있습니다.
