이 방법은 백혈병 세포에 있는 신진 대사 통로 설치에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 실시간으로 1 차 백혈병 세포의 물질 대사를 측정할 수 있다는 것입니다. PBS에 있는 백혈병 환자에게서 얻은 골수 견본을 1 대 1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다.
신중하게, 15 밀리리터 원추형 튜브에서 갓 준비된 밀도 그라데이션 배지의 6밀리리터 위에 희석된 골수 샘플의 6밀리리터를 층으로 적층하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 단일 핵 세포의 인터페이스 층을 원심 분리 세척을 위해 PBS 5 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 원전 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 이어서, 단일핵 세포 펠릿을 계산용 멸균 PBS의 2밀리리터로 재중단한다.
밀리리터 농도당 7개의 세포에 세포를 3배 10으로 희석시. 그리고 37섭씨 37도및 5%CO2에서 16~24시간 배양에 대해 RPMI 배지 20밀리리터를 함유한 2개의 T75 플라스크 각각에 1밀리리터의 세포를 추가합니다. 한편 세포 외 플럭스 분석을 위해 플레이트를 준비하기 위해 세포 접착제 용액 12.5 마이크로리터를 각각 2개, 8개의 잘 세포외 플럭스 분석기 플레이트에 추가합니다.
20 분 후, 세포 접착제를 흡착하고 세척 당 멸균 물 200 마이크로 리터로 각각 두 번 잘 씻습니다. 두 번째 세척 후, 우물이 건조 할 때까지 후드에 접시를 둡니다. 그리고 센서 카트리지를 실험실 벤치에 거꾸로 놓습니다.
플럭스 분석기의 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리합니다. 그리고 200 마이크로리터의 교정제와 각 해자 400 마이크로리터의 교정판으로 유틸리티 플레이트의 각 우물을 채웁니다. 센서 카트리지를 교정판이 들어 있는 유틸리티 플레이트로 되돌리고 밤새 CO2 없이 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 카트리지 어셈블리를 배치합니다.
그런 다음 세포 외 플럭스 분석기를 켜고 밤새 섭씨 37도까지 따뜻하게 하십시오. 다음 날 아침, 원심 분리를 위해 플라스크에서 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 옮긴다. 그리고 계산에 적합한 실험 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
실험적인 중간 농도의 400 마이크로리터에서 6개의 세포에 4회 10에서 세포를 재중단합니다. 그리고 플럭스 분석기 플레이트의 G를 통해 50 마이크로리터의 셀 B에 첨가한다. 그리고 180 마이크로리터의 실험 매체를 우물 A와 H로 배경 제어 우물로 한다.
원심분리 후 천천히 조심스럽게 G.를 통해 B에 실험 배지의 130 마이크로리터를 첨가하고 현미경하에서 각각의 바닥에 세포의 안정적인 준수를 시각적으로 확인한다. 그런 다음 30 분 동안 CO2없이 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 플럭스 분석 플레이트를 반환합니다. 인큐베이션이 끝나기 20분 전에, 테이블에 표시된 실험 프로토콜에 따라 카트리지의 적절한 인젝터 포트에 화합물을 적재한다.
그런 다음 적절한 세포 외 형플럭스 분석 프로그램을 설정합니다. 프롬프트시 프로그램을 시작하고 교정판을 분석판으로 교체합니다. 글리코리시스 스트레스 테스트에서는 세포가 영양소를 박탈당할 수 있도록 기저 배지만 사용됩니다.
얻어진 첫번째 파라미터는 세포에 저장된 포도당의 양을 반영해야 하는 기저산성화이다. 첫 번째 주사 후, 세포가 포도당을 이용함에 따라 세포 외산성화율이 증가하고 젖산에 포도당을 발효시킬 수 있다. 제2 주사에서 올리고마이신 A는 ATP 시차스를 억제하고 따라서 세포 외 산성화 속도의 추가 상승을 일으키는 글리코리시스에 의해 주로 ATP를 생산하도록 세포를 지시한다.
2-Deoxy-D-포도당의 주입은 완전히 글리코분해및 세포외 산성화 속도 저하를 억제하는 동안. 세포 미토 스트레스 테스트에서 글루타민과 포도당으로 보충된 배지가 사용되어 세포가 모든 영양소를 박탈당하지 않도록 합니다. 기저 호흡 매개 변수는 기저 대사 상태를 반영합니다.
올리고마이신 A를 가진 첫번째 주입 후에, 세포는 미토콘드리아 호흡을 억제하고 산소 소비속도의 감소로 표현되는 글리코리솔로 전환합니다. 그러나 FCCP의 두 번째 및 세 번째 주사는 ATP 생산을 호흡으로부터 분리하여 세포가 이제 최대 속도로 산소를 소비합니다. 그리고 산소 소비율은 가장 높은 값으로 상승합니다.
로테네와 항마이신 A 혼합물의 마지막 주사는 미토콘드리아 호흡을 완전히 억제하여 산소 소비속도를 거의 0으로 감소시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 백혈병 폭발의 대사 매개 변수만 측정되도록 샘플에서 폭발의 비율을 평가하는 것이 중요합니다. 이 방법을 구현할 때 재배 조건 및 데이터 정규화에 신중한 최적화를 적용해야 합니다.
