이 방법은 산소에 민감한 금속을 포함하는 단백질에서 효소 활동을 유지하는 방법에 대한 분야 무기 생화학의 주요 질문에 대답하도록 설계되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질의 금속을 감소 상태로 유지할 수 있는 방법을 시각화하는 데 도움이 된다는 것입니다. 일반적으로, 이 기술에 새로운 개별은 완전히 혐기성되기 위하여 재료 및 시약을 유지하기 어렵기 때문에 투쟁할 것입니다.
단백질 발현을 유도한 후 24시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 1.5리터당 아밀로오스 컬럼 버퍼20밀리리터로 세균세포 펠릿을 재연한다. 세포 현탁액에 리소지메 1밀리그램을 넣고 얼음 에 20 분 동안 세포를 저어줍니다. 인큐베이션이 끝나면 약 15, 000 psi에서 3~5번의 통과로 고압 균질화를 통해 재중단된 세포 용액을 lyse시키고 단백질을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 전달한다.
헤드스페이스를 질소로 1분간 플러시하고, 세포 용해를 원심분리하여 불용성 이물질을 제거합니다. 상체를 적어도 하나의 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 고무 중격으로 용액을 캡. 20 게이지 바늘을 사용하여 용액을 통해 질소 가스를 천천히 거품하여 산소를 대체합니다.
그런 다음, 파라핀 필름으로 중격을 감싸고, 파라막을 구리 와이어로 고정하고, 상체를 기둥 재료로 장갑 상자에 넣습니다. 용매가 수지 침대 바로 위에 있을 때, 이전에 준비된 아밀로오스 컬럼에서 50밀리리터의 단백질 상부체를 컬럼에 적재하여 분당 약 5밀리리터에서 적당히 가압된 질소 하에서 5밀리리터 분획으로 유동을 수집한다. 모든 흐름 스루가 용출되면 열을 아밀로스 컬럼 버퍼의 또 다른 세 열 볼륨으로 세척합니다.
용출 버퍼의 다섯 CV를 추가 한 다음 적당히 가압 된 질소에서 유리 테스트 튜브에서 3 밀리리터 분획을 수동으로 수집합니다. 철암모늄 황산염 및 디티오스레이톨로 산소 존재용 솔루션을 테스트합니다. 산소가 존재하는 경우 용액은 어두운 파란색 또는 검은 색으로 바뀝니다, 오른쪽에있는 튜브처럼.
산소의 존재는 낮은 촉매 활성정제 단백질귀착될 것이다. 산소가 최소한의 용액은 왼쪽의 튜브와 같이 라벤더 또는 밝은 파란색 반투명 색상이 될 것입니다. 다음으로, 외부 질소 라인을 사용하여 교반 된 세포 챔버를 가압하고 단백질을 적당한 교반 속도로 2 번 50 밀리리터에 농축합니다.
이어서, 단백질을 10 밀리리터에 농축하고, 0.45 마이크로미터-공공 주사기 필터를 통해 농축 단백질을 걸러내는다. Aliquot 150 마이크로리터 의 단백질은 개별 200 마이크로 리터 폴리머 라제 연쇄 반응 튜브로. 그런 다음 장갑 상자에서 덮인 알리쿼트를 제거하여 액체 질소로 즉시 플래시 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
DesB 탈염의 경우 먼저 9밀리리터 보로실리케이트 컬럼에 세 밀리리터 의 세 밀리리터를 추가하고 두 개의 열 량의 탈염 버퍼로 컬럼을 세척합니다. DesB가 해동되면 중력 제어 과정을 통해 정제된 단백질을 컬럼에 적재하고, 약 5밀리리터의 탈염 완충제와 함께 12개의 바이알에 3방울의 단백질을 희석하기 전에 흐름을 폐기한다. 산소 전극을 준비하려면 가위를 사용하여 약 1.5 인치 평방 피트의 스페이서 용지를 자르고 작은 삼각형을 사각형의 각 면에 자르고 모서리에 슬릿을 사용하여 전극의 래핑을 돕습니다.
50% 칼륨 염화칼륨 용액을 전극의 실버 양극 홈에 넣고 방울을 연결하여 연속적인 용액 고리를 형성합니다. 염화물 칼륨 용액 2방울을 백금 전극 위에 넣고, 스페이서 용지를 백금 전극 위에 조심스럽게 놓고 스페이서 용지를 부드럽게 하여 기포가 없도록 합니다. 약 2인치 길이의 S4 30m PTFE 멤브레인을 자르고 스페이서 용지 위에 놓고 멤브레인의 가장자리를 제거하여 전극의 외부 링과 정렬합니다.
O-링 어플리케이터를 사용하여, 전극에 스페이서 종이와 멤브레인을 고정하기 위해 전극 위에 작은 O-링을 밀어, 전극의 원형 홈에 더 큰 O-링을 배치, 아래에 멤브레인이 없다는 것을 주의. 전극의 상단 챔버를 베이스에 밀어 넣고 두 조각을 함께 나사로 연결합니다. 조립된 전극을 베이스에 놓고 전극을 모니터링 시스템에 연결합니다.
효소 반응의 속도를 결정하려면 컴퓨터 통합과 함께 산소에 민감한 클라크 형 전극을 사용하여 전극 제어 장치를 통해 산소 소비를 측정하십시오. 전극 챔버에 적절한 기판 부피에 Tris 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 10 초 동안 용액을 저어줍니다. 10초 후 플런저로 챔버를 천천히 밀봉하고 상단을 아래로 나사로 연결합니다.
깨끗한 조직을 사용하여 챔버에서 변위되는 과잉 액체를 흡수하고, 전극이 용액에서 산소 농도의 안정적인 측정을 생성할 수 있는 위치를 상화할 수 있도록 1분 이상. 다음으로, 가스가 단단한 10마이크로리터 주사기를 사용하여 플런저를 통해 전극 챔버에 약 1마이크로리터의 효소를 추가하고 속도 데이터를 수집한다. 주어진 기판 농도에 대한 모든 속도가 수집되면, 측면 팔 진공 플라스크에 연결된 플라스틱 튜브를 사용하여 전극 챔버를 비우고, 물로 4 ~ 6 사이클 동안 챔버를 반복적으로 헹구십시오.
그런 다음, 새로운 기판 농도를 사용하여 방금 입증된 대로 전극에 용액을 설정합니다. SDS-PAGE 젤 분석은 DesB-maltose 결합 단백질 융합 구조에서 개별 분획의 분석은 서로 갈라진 DesB 및 말토세 결합 단백질 도메인 제품의 존재를 제외하고 순수한 단백질 제품의 분리를 드러낸다. 일단 모든 운동 측정이 취해지면, 갈레이트를 갖는 DesB의 활성은, 예를 들어, 다양한 갈레이트 농도에서 산소 소비속도를 측정하여 얻을 수 있다.
반대로, 4니트로카테콜을 가진 DesB의 억제속도는 4니트로카테콜의 다양한 농도가 존재하여 1밀리알라갈레이트로 데스B의 산소 소비율 감소를 관찰함으로써 결정될 수 있으며, 예를 들어, 4니트트로카테콜은 산소소비를 억제하고 그에 의해 DesB 반응을 나타낸다. 이 방법은 철의존 디산소 효소를 연구하는 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 금속 로엔자임과 같은 다른 시스템에 적용 될 수 있습니다. 글러브 박스 안에서 일하는 것이 어려울 수 있으므로 이 기술을 수행하는 동안 서두르지 않도록 주의하십시오.
