이 작품은 NIH (DC007681, AB), CT 줄기 세포 기금 (AB), Pardee 재단 (AB), Predoctoral 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 (NRSA) (SZY) 및 NSF 대학원 연구에서 보조금에 의해 지원되었다 휄로 십 (BL). 우리는 원고에 대한 유용한 의견을 Bordey 실험실 구성원을 감사드립니다. 현재 자료는 부분적으로 코네티컷의 줄기 세포 연구 보조금 프로그램의 코네티컷 주에서 지원 작업에 기반을두고 있습니다. 의 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 코네티컷 주의 공식 전망을 대변하지 않습니다, 코네티컷 또는 중부 표준시 혁신의 주 공중 보건학과가 통합되었습니다.

1. 솔루션, 해부, 그리고 Vibratome의 작성 <ol><li> 솔루션은 올바른 osmolarity와 산도 (표 1)에서 준비해야합니다. 인공 뇌척수 (ACSF)에 비해 분해 솔루션은 나트륨과 칼슘의 낮은 농도와 마그네슘의 높은 농도로 준비가되어 있습니다. 이 썰기 동안 excitotoxicity 효과를 최소화하는 것입니다. </li><li> 모두 해부 및 ACSF 솔루션은 95% O 5분의 2 % 7.3 원하는 pH를까지 적어도 10 분 동안 버블 링에 의한 CO 2.로 포화되어 있어야합니다 </li><li> 트레이에 얼음 목욕을 준비합니다. 얼음 욕조에서 해부 접시를 놓고 분해 솔루션을 작성하십시오. 버블 절개 판입니다. </li><li> 얼음 목욕을 만들어 vibratome를 준비합니다. 얼음 욕조에 sectioning 요리를 놓고 해부 솔루션, 풍선과 함께 요리를 입력합니다. </li><li> 그 솔루션을 보장하기 위해 ACSF과 거품과 챔버를 가지고있는 슬라이스를 작성하는 것은 적절 관계없이 aerated 수 있습니다조각이 배치되는 위치의. </li></ol> 2. 뇌 조직의 제거 급성 뇌 조각은 젊은 쥐와 건강 경향이 있습니다. 설치류에서 출생 후의 SVZ의 세포 구조는 출생 후의 일 (P) 20 1 시경 발전되어 있습니다. 따라서, 우리는 P20-P30의 마우스 세에 우리의 실험을 제한하려고하지만 3 개월로 이전과 같은 마우스에서 성공 실험을 수행했습니다. 조직의 취급 전반에 걸쳐, 하나, 기계적 움직임과 뇌에 압력을 최소화 냉각 조건을 유지 및 솔루션 최대한 신속하게 다음과 희생에 SVZ를 노출주의해야합니다. <ol><li> pentobarbital의 주입 후, 마우스는 급속하게 목이 잘 렸나하고 있습니다. 털은 제거되고 절개는 두개골의 기지를 통해 이루어집니다. 머리 그 다음 해부 솔루션들로 가득 찬 트레이에 위치합니다. </li><li> 집게로 머리를 안정 있지만, 지속적인 상처는 두개골 주위에 만들어 때로는 microsc로 중간 선까지issors. 조직과 접촉을 최소화 할주의하십시오. 후각 망울이 SVZ에서 신생아 뉴런의 최종 목적지이기 때문에, 하나는 특히이 지역 주변의 뼈를 제거하는 동안 그 지역을 보존 염두에두고 있어야합니다. 두개골 주위를 한 Microscissor ​​상처는 두개골 쉽게 제거 할 수 있도록하기 위해, 등쪽의 옆에 있어야합니다. </li><li> 뇌를 놓인 두개골의 제거는 이제 뇌 아래에있는 뼈로부터 분리되어 있습니다. 이전 단계에서 상처가 제대로 된 경우,이 놓인 뼈는 핀셋이나 집게로 쉽게 제거 할 수 있습니다. </li><li> 여전히 집게로 머리를 누른 상태에서, 하나는 깔끔하게 다음과 같은, 썰기 이전에 뇌 조직의 여러 조각을 제거하는 수술 블레이드를 사용할 수 있습니다. 코로나 컷은 람다 수준에서 만들 수 있습니다. 시상 상처는 SVZ에 측면 뇌의 양쪽에 만들 수 있습니다. 보수적 인 추정은 중간 선에서 ~ 2.5 mm 것입니다. 원하는 경우, 뇌도 여기 hemisected 할 수 있습니다. 이러한 상처는 모두 것처럼 것조직의 장착 itate과 뇌 썰기 때 SVZ가 더 빨리 도달 할 수 있습니다. 그 약은 뇌 (예 : 밀어 또는 안 나오는데)에 기계적 힘의 최소한의 금액을 발휘하는 것을 잊지하는 것이 중요합니다. </li></ol> 3. 급성 뇌 슬라이스 준비 <ol><li> , 다음 단계를 준비​​ 조직을 마운트하는 데 사용되는 슈퍼 접착제는 나막신의 무료 vibratome 판에 적용 할 준비가되어 있는지 확인합니다. 그 약은 뇌를 손상시키지 않고 최대한 빨리 가능한 이동하는 것이 중요합니다. </li><li> 뇌 세포는 동시에 신경을 분리하는 동안 기본 뼈에서 조직을 분리 아래에에서 갔었 할 수 있습니다. </li><li> 조직은 마운트 플레이트에 접착하고 vibratome에 표시됩니다. SVZ의 뱃 부리 장식이있는 - 꼬리 해부학로 인해 우리는 neuroblasts의 이동 경로, glial 집, 그리고 대부분이 방향으로 정렬되어있는 vasculature를 보존으로 시상 조각을에 초점을 맞추고 있습니다. 하나는 MO 중 하나를 수행 할 수 있습니다중간 선이나 SVZ에 측면 시상 삭감을에 의해 생성 된 평면 표면에 조직을 unt. 선택 단계는 슬라이스를 잘라야으로 블레이드에 받침 역할을하는 조직 뒤에 3 % 아가로 오스 블록을 배치하는 것입니다. 우리는 우선적으로 시아 노 아세틸렌 기반의 슈퍼 접착제를 사용했습니다. </li><li> 오일을 제거하고 증류수로 씻어하기 위해 에탄올과 칼을 씻어. 블레이드 홀더에 칼을 놓으십시오. vibratome에 블레이드 홀더를 탑재합니다. </li><li> 슬라이스 당 250-350 μm의 두께로 조직을 잘라 vibratome 설정을 조정합니다. 이 고주파 진동 및 낮은 속도를 사용하여 절단하는 것이 중요합니다. </li><li> 점진적으로 조직을 통해 섹션을 참조하십시오. 후각 망울의 모양은 사람이 가장 옆 조각은 어느 지역을 포함으로 시상 슬라이스의 SVZ 근처에있는 좋은 지표입니다. 찾아 다른 랜드 마크 심실과 SVZ가있는 아래의 코퍼스 callosum의 증점 안정제가 포함되어 있습니다. SVZ 더 측면 sagit에서 처음 나타납니다탈 조각. RMS는 중간 시상 슬라이스에 표시됩니다. </li><li> 끝이 끊어과 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 SVZ를 포함하는 슬라이스를 제거합니다. 슬라이스 지주 챔버에 받고 있습니다. 우리는 종종 우리가 작업 하루에 사용할 수있는 것보다 더 많은 조각을 얻습니다. 그러나, 조각이 SVZ를 포함하는 세포의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 이 영상에 원하는 하나를 찾기 위해 몇 조각을 찾아하는 것이 필요합니다. </li></ol> 4. 현미경과 염료의 작성 조각은 절개와 썰기를 복구 할 수 ACSF에 1 시간 배양 시간을 필요로합니다. 몇 가지 단계이 슬라이스 복구 기간 동안 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 칼슘 염료 및 / 또는 약물 응용 프로그램에 대한 피펫의 준비 <ol class="lalpha"><li> 유리 피펫은 직경 팁 길이 (~ 2 ㎜)과 재관류 챔버과 접촉을 방지 각도 (~ 16 ° 피펫 홀더 용)에 2-3 μm의 팁이 필요합니다 및 게재 위치에 대한 공간을 수 있습니다목표. </li><li> 하나는 일반적으로 실험을 매일 6-8 압력 피펫을 준비 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 칼슘 염색 준비 <ol class="lalpha"><li> 작업 솔루션을 (욕조의 4-5 μM, 250 μM 압력 응용 프로그램) 준비 할 때, 셀에 DMSO의 최소 금액을 표시하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 매우 집중 주식을함으로써 달성 될 수있다. 예를 들어, Fluo - 4, 50 μg을 포함 한 튜브는 하루에 사용됩니다. 하나는 DMSO의 Pluronic F-127 20 % 솔루션의 4.6 μl를 추가하여이 나누어지는의 10 MM 주식을 만들 수 있습니다. </li></ol></li><li> 현미경 설정 (그림 2)를 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 솔루션 흐름에 연동 운동의 펌프를 사용 이미지 드리프트를 최소화있었습니다. ACSF는 재관류 라인을 통해 실행하고 풍선 무료입니다 보장 할 수 있도록 사전에 연동 운동의 펌프를 실행합니다. </li><li> 재관류 챔버에 튜브 입구를 설정하고 누수가없는 보장합니다. </li><li> 엔터프라이즈 네트워크에 진공 팁을 위치솔루션은 재관류 챔버에서 흡입되는 것을 우레. 그 목적은 적절한 작동 거리에 몰두하지만, 이러한 그 솔루션은 챔버 넘치다 수 있도록 높은되지 않습니다 않도록 적절한 수준으로 설정되어 있는지 확인합니다. 솔루션의 낮은 수준은 흐름 왜곡을 최소화합니다. 상수 흡인도 steadiness를 수신하여 확인할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 염료 로딩 이 방법은 다른 원고 2에 자세히 설명되어 있습니다. 그 안에 그림을 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 목욕 로딩 염료 <ol class="lalpha"><li> 염료의 1-2 ML 작업 솔루션을 확인하십시오. AM Fluo-4를 들어, 4-5 μm의 농도는 SVZ의 neuroblasts을 라벨에 적합합니다. </li><li> 조각 먼저 이미 ACSF로 가득 메쉬 바닥과 35mm 문화 요리에 전송됩니다. 동시에 C를 추가하는 동안, 부드럽게 ACSF를 제거하는 3 ML 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 솔루션을 교체alcium 염료 솔루션을 작동. </li><li> 5 % CO 2 가스 제어 된 환경에서 30-60 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 세포를 입력하지 않은 염료를 씻어하는 ACSF이 가득한 가지고 챔버에 다시 슬라이스를 놓습니다. 또한, 하나는 ACSF을 실행하는 현미경 재관류 챔버에 직접 배치 할 수 있습니다. 이 세차 기간은 30-45 분입니다. </li><li> 재관류 챔버에 슬라이스를 전송합니다. </li></ol></li><li> 염료의 압력 응용 프로그램을 <ol class="lalpha"><li> 홀딩 챔버에서 현미경 설정에서 재관류 챔버에 슬라이스를 전송합니다. </li><li> micromanipulator에 250 μM 및 장소 인 작업 솔루션으로 유리 피펫을 입력합니다. </li><li> 관심 지역에 피펫을 낮 춥니 다. 피펫은 끝이 떨어져 녹음 지역에서 두 슬라이스 표면 아래에 몇 마이크로 미터 슬라이스 표면 위 또는 매장 몇 마이크로 미터이지만, 그러한 배치 할 수 있습니다. 피펫의 각도는 affe 안중부 표준시로드 효율. 슬라이스 표면 아래의 이미지는, 우리는 이미징 비행기 아래의 피펫 팁을 배치하는 것이 더 나은 원하는 이미지 영역을 레이블 것을 발견합니다. </li><li> 이 &lt;3 PSI이되도록 압력이 염료를 적용하면 Picospritzer을 설정할 수 있습니다. 이 피펫 팁 직경의 다양성에 따라 달라질 수 있습니다 때문에 우리는 염료 확산의 볼륨을 추정하지 않은, 압력을 적용하고, 염료가 주입되는 조직의 밀도. 눈으로 평가로 우리가 원하는로드를 달성 할 때까지 우리는 간단하게 적용 할 수 있습니다. 끝이 슬라이스 표면 바로 아래에 위치 특히, 응용 프로그램 중에 슬라이스에 손상을 최소화합니다. 1-2 분 동안 적용됩니다. 때때로 반복 응용 프로그램은 눈으로 평가로 라벨에 따라 필요합니다. 이 농도 및 응용 프로그램 기간 동안, 우리는 표면 응용 프로그램을 아래 우선적으로 astrocytes에 이름표를하면서 염료의 표면 응용 프로그램이 우선적으로 neuroblasts에 이름표를 찾습니다. 그러나, 500 μM에서&gt; 3 분 응용 프로그램은 neuroblasts 표시되며에 관계없이 끝이 위 또는 아래에있는 슬라이스 표면 (JC Platel, 게시되지 않은 관찰)입니다 여부. 30-45 분에 대한 세척 및 슬라이스 복구를 위해 허용합니다. </li></ol></li></ol> 6. 칼슘 활동 공 촛점 이미징 <ol><li> 이러한 4 배 또는 10 배와 같은 낮은 전력 목적으로 첫번째 관심 지역을 찾아보세요. 높은 전력 목표로 전환하기 전에 필드의 중앙에 놓습니다. 이 시점에서, 하나는 차등 간섭 대비 (DIC)에서 SVZ 세포의 모양을 지적하여 일반 슬라이스 건강을 평가 할 수 있습니다. 건강한 세포는 원형 통통 나타납니다. 전부 또는 밝은 형광 (죽어 셀)에서 노로드로해야로서뿐만 아니라, 건강한 세포는 희미한 Fluo-4 로딩을 표시합니다. </li><li> 관심 지역에 물 침지 목표를 낮추고, 이는 현재 염료로드됩니다. 40x는보기의 넓은 필드를 제공하고 더 피펫에 액세스 할 수 있지만, 40x 또는 60x 목표 중 하나는 우리의 필요에 따라 적절한되었습니다. 하면 아래의 이미지표면, 우리는 종종 3 dimentional 건축과 세포의 건강을 더 잘 보존되어 슬라이스 표면 아래에 최소 15 μm를 이동합니다. </li><li> 재관류 및 진공 충분히 작동하는지 확인합니다. </li><li> 그 시간 경과 해상도와 공간 해상도가 원하는 속도로 설정되어 있도록 현미경을 설정하십시오. 공 촛점 현미경를 들어, 이러한 요소는 일반적으로 시스템의 스캐닝 특성으로 인해 공간 해상도의 손실 결과 시간적 해상도의 증가로 균형을해야합니다. 칼슘 활동을, 우리는 512x512 픽셀 해상도를 가진 약 매초마다 프레임을 이미지로하고 있습니다. 별도로 구입 한 여러 채널이 필요하면,이 또한 수집 속도에 영향을 미칩니다. 동영상의 기간 (2-10 분)을 설정합니다. </li><li> 실행을 시작합니다. 약리 연구를 수행하는 경우, 적어도 5-10 분 동안 antagonists 또는 비 desensitizing agonists에 씻어 후 5-10 분의 또 다른 영화를 확인하십시오. 수용체 감도를 줄이다 수 있습니다 Agonists가 심하게 PR을 사용하여 같은 적용 할 수 있습니다micromanipulator에 의해 제어 피펫을 essure. </li></ol> 7. 칼슘 분석 분석은 우리가 투과시키는 출판물에 2-4 설명하는 표준 절차를 따릅니다. F 0 (즉, 기준) 및 F 관심 (ROIs)의 지역의 모든 전역 및 각 투자 수익 (ROI)에 측정 한 평균 형광 강도, 각각 있습니다. 형광의 변화는이 F / F 0 증가&gt; 15 %입니다 경우 칼슘 2 + 증가로 간주되었다. 세포 내 칼슘 2 + 변경 사항이 Calsignal 5를 사용하여 계산 하였다. 8. 대표 결과 우리는 위 다른 2-4,6 설명 염료로드 프로토콜에 따라 SVZ 세포의 선택적 로딩을 얻을 수있었습니다. 대부분 Fluo-4시 (각각 4-5 또는 250 μM) 라벨 neuroblasts의 슬라이스 표면에 목욕로드 또는 압력 응용 프로그램입니다. 압력 응용 프로그램은 neurob을로드 할 수 있지만보다 신속하게 하나의 슬라이스에 목욕을로드하는 것보다 지속, 목욕로드는 여러 조각의 동시로드 할 수 있습니다. Google은 철새 행동 4,7, (2)의 형태, sulforhodamine 101 (3) 부정적 착색, astrocyte 특정 염료 3 (4) 긍정적 인 염색법과를 표시 여부 (1)에 의해 neuroblasts로 분류 세포의 신원을 확인 DCX-DsRed 표현 (JC Platel, 게시되지 않은 관찰). Neuroblasts은 생리적 온도 4,7-9에서 (60 μm / 시간의 평균) 빠르게 마이그레이션 있지만 운동은 쉽게 실온에서도 볼 수 있습니다. neuroblasts의 움직임은 우리의 영화는 일반적으로 기간이 짧은 때문에 지역 수준의 관심 (ROI)은 칼슘의 활동을 추적하기 위해 배치와 관련이있는 문제를 일으킬하지 않습니다. 그러나, 약물 솔루션 교류 동안 같은 긴 대기 기간, 동안, 수사관들이 제어 및 치료 기간에 ROIs 일치하도록주의해야합니다. neuroblasts은에 또는 내가 밖으로 이전하는 것은 흔하지 않은 일은 아니지<html> maging 필드 또는 초점 비행기. 슬라이스에 제한된 기간 (&lt;2 분)에 대한 깊은 Fluo-4시 (250 μM)의 압력 응용 ​​프로그램은 우선적으로 SVZ의 astrocytes에게 2 레이블. Astrocyte 라벨은 특히 우리가 최근 3 설명이 혈관에 투영 및 endfeet의 존재에 의해, sulforhodamine 101의 형태로 긍정적 인 상표에 의해 확인되었습니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 SVZ의 neuroblast와 astrocyte 인구 (그림 1) 모두에 자발적인 활동을 관찰했다. astrocytes의 활동은 종종 혈관 3 참여 파도의 형태로 걸립니다. 또한, 분석으로 칼슘 이미징을 사용하여 약리 agonists의 응용 프로그램이 공개 또는 GABA의 표현 neuroblasts 4 neuroblasts과 astrocytes 6 수용체, AMPA와 NMDA 수용체가를 확인했습니다. 그림 1 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. astrocytes에 칼슘의 활동을 확산. (A) 대표는 칼슘 활동의 시간 경과 기록에서 이미지를 평균 한 값입니다. SVZ의 Astrocytes이 Fluo-4의 압력 응용 프로그램과 함께로드 된 것은 슬라이스로 깊이입니다. 영화는 0.75의 시간 단계에 인수되었다. 관심 영역 (ROI) 활동을 전시 셀 위에 배치됩니다. (B) ROIs의 흔적은 (A)에 도시 된 영화의 세포 위에 위치. 흔적은 이동 평균과 표준화를 필터링되었습니다. 수직 규모는 2를 나타냅니다 X ΔF / F는 신호 강도이며, F 0의 평균 기준 신호와 ΔF = FF 0 F 0. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> 그림 2. 재관류 시스템의 사진. 튜브의 한쪽 끝은 95% O 5분의 2 % CO 2 가스-P에 잠겨있다erfused 솔루션입니다. 솔루션은 다음 연동 운동의 펌프 (미도시)에 의해 튜브를 통해 목욕 챔버에 perfused 있습니다. 다른 쪽 끝은 플랫폼에 장착 목욕 챔버의 솔루션 입구에 삽입됩니다. 흡인 팁은 다음 챔버의 솔루션 콘센트에 연결 및 솔루션 높이를 결정하는 수준에서 설정됩니다. 콘센트에서 흡인 팁은 챔버에서 폐기물 용기에 솔루션을 aspirates 진공 라인에 연결되어 있습니다. 재관류 시스템은 시각적 명확성을 위해 현미경 단계를 표시됩니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

SVZ 세포의 칼슘 이미징은 neuroblasts 10 모두 neuroblasts 및 astrocytes 4,6,8 및 astrocytic 칼슘 웨이브 3 수용체 채널 표현의 자발적인 활동에 패턴을 공부하는 데 사용되었습니다. SVZ의 세포 중 유치 또는 glial 속성을 가지고 있기 때문에, 그들은 성숙 네트워크 활동을 나타내는 전압 잠재적으로 밀리 변경이 지역에서 적용되지 않습니다 즉, 행동 할 가능성 11,12를 해고하지 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 용질 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 해부 (㎜) </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 </td><td> S0389 </td><td> 해부 : 147 MM ACSF : 0 MM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S9888 </td><td> 해부 : 42 MM ACSF : 126 MM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P3911 </td><td> 해부 : 2.5 MM ACSF : 2.5 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 0.6 H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M9272 </td><td> 해부 : 4.33 MM ACSF : 1 MM </td></tr><tr><td> 2 PO 4 아뇨. H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> S8282 </td><td> 해부 : 1.25 MM ACSF : 1.25 MM </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G8270 </td><td> 아까 그 바 말인데,ction : 10 MM ACSF : 10 MM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6014 </td><td> 해부 : 26 MM ACSF : 26 MM </td></tr><tr><td> CaCl 2 0.2 H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3306 </td><td> 해부 : 1.33 MM ACSF : 2 MM </td></tr></tbody></table> 표 1. 화학 목록 및 해부 솔루션과 ACSF의 요리. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [헤더] </td></tr><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> 슈퍼 접착제 </td><td> Surehold 또는 3M </td><td> Surehold 3G 슈퍼 접착제 또는 3M 다한 본드 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 도구 </td><td> Roboz 또는 테드 펠라 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4는 칼슘에 민감한 염료 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 BAPTA-1은 칼슘에 민감한 염료 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO의 Pluronic F-127 20 % 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> 입식 공 촛점 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV300 또는 FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> 물 침지 목표 </td><td> 하늘 </td><td> LUMPlanFl 40 X W / IR (NA 0.80), LUMPlanFl 60 X W / I (NA 0.90) </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 </td><td> 셔터 </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> 압력 컨트롤러 &lt;/ TD&gt; <td> 파커 Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> 신청시 &lt;3 PSI </td></tr><tr><td> 피펫 풀러 </td><td> 셔터 또는 Narshige </td><td> 셔터 P-97 또는 Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 피펫 </td><td> 셔터 </td><td> BF150 - 110-10 </td><td> ID : 1.10, OD : 1.50 </td></tr><tr><td> 연동 운동의 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 모델 720 </td><td> 유량 : 1 ML / 분 </td></tr><tr><td> 상공 회의소 목욕 </td><td> 워너 악기 </td><td> RC-26 GLP </td><td> 낮은 프로파일 목적 통관을 허용 </td></tr><tr><td> 관의 설치 </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 온도 컨트롤러 </td><td> 워너 악기 </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 재료 / 장비 목록입니다.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후의 뇌의 두 neurogenic 지역 중 하나입니다. SVZ는 astrocytic 기능 (SVZ의 astrocytes라고도 함), neuroblasts, 그리고 중간 전구 세포와 신경 전구 세포 등의 밀도가 높은 포장 세포가 포함되어 있습니다. SVZ에서 태어난 Neuroblasts는 tangentially가 interneurons로 차별화 후각 망울에 큰 거리를 마이그레이션. 접착 분자와 diffusible 신호를 통해 세포 신호는 제어 neurogenesis에 중요한 역할을 재생합니다. 이러한 신호의 대부분은 세포 내부와 사이에 정보를 전송 세포 칼슘 활동을 실행. 칼슘 활동은 세포 신호의 활동 따라서 반사하고 SVZ 세포 간의 기능적 세포 신호를 이해 할 수있는 최적의 방법입니다. 칼슘 활동이 성숙 astrocytes 뉴런 등 많은 다른 지역과 셀 유형,에서 공부하고 있습니다. 그러나, 로아에 전통적인 방법칼슘 표시기 염료 (예 : 욕조로드)와 D 세포는 모든 SVZ 세포 유형을로드에 효율적 아니 었습니다. 사실, SVZ의 세포 밀도는 조직 내부에 염료 확산을 precludes. 또한, 시상 조각을 준비하는 것은 더 나은 특히 SVZ 세포, 뱃 부리 장식이있는 - 꼬리 축에 neuroblast 이주의 흐름의 3 차원 배열을 유지합니다. 여기, 우리는 SVZ, 칼슘 표시기 염료와 SVZ 세포의 로딩, 시간 경과 영화와 칼슘 활동의 인수를 포함하는 시상 부분을 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 사용 Fluo-4는 조직 내부 압력 응용 프로그램을 사용하여 SVZ의 astrocytes를로드하는 염료입니다. 칼슘 활동이 구별 개별 셀에 대한 정확한 해결책을 허용 스캔 공 촛점 현미경을 사용하여 기록되었다. 우리 접근 방식은 성인 hippocampal subgranular 영역과 배아 neurogenic 구역 등 다른 neurogenic 영역에 적용됩니다. 또한, 염료 다른 유형의 수설명 방법을 사용하여 적용 할 수.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K 조회수.  Yale University School of Medicine. 기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

연구

신경과학

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 뇌실하 영역에서 분리된 NSC의 효율적인 핵 분석

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Improved Nucleofection for High-Efficiency Gene Delivery in Murine Subventricular Zone-Derived Neural Stem Cell Cultures

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...