이 프로토콜은 탈상피화 및 기도 조직 재생과 같은 상이한 조직 조작 절차 동안 단리된 기도 조직의 시험관내 배양 및 직접적인 현미경적 시각화를 허용한다. 본 연구에서 제안된 계내 영상화는 내인성 상피의 영상화 유도 조절된 제거 및 외인성 세포의 전달 동안 기관 내강의 신속하고 비파괴적인 모니터링을 가능하게 한다. 영상화-유도된 생체반응성 플랫폼 및 조직 조작 프로토콜은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 생체공학적 기도 조직을 생성하는데 사용될 수 있다.
이미징이 가능한기도 조직 생물 반응기의 건설 및 사용은 우리의 연구 그룹 인 Mohammad Mir와 Jiawen Chen의 두 박사 과정 학생에 의해 입증 될 것입니다. 현장 이미징 장치 제작을 시작하려면 튜브 렌즈를 적층 가능한 렌즈 튜브에 삽입하고 고정 링을 사용하여 고정하십시오. 그런 다음 렌즈 테이블 어셈블리를 C-마운트 어댑터를 통해 과학적인 CMOS 카메라에 장착합니다.
Micromanager 소프트웨어를 사용하여 카메라를 작동하고 사진 및 비디오를 획득하십시오. 카메라에서 10m 떨어진 곳에 있는 물체를 조준하는 동안 컴퓨터 화면에 물체의 초점이 맞춰진 이미지가 형성될 때까지 튜브 렌즈와 카메라의 이미징 센서 사이의 거리를 조정하십시오. 그런 다음 조립 로드, 나사식 케이지 플레이트 및 케이지 큐브와 같은 광학 케이지 시스템 구성 요소를 사용하여 이중 에지, 초해상도, 이색성 미러 및 레이저에 필터 렌즈를 장치에 장착합니다.
20X 대물 렌즈를 장치에 연결합니다. 그런 다음 X-Y 변환기를 통해 렌즈 튜브의 원위 끝에 직경 500 마이크로 미터의 녹색 렌즈를 장착하십시오. 녹색과 대물 렌즈 사이의 거리를 조정하여 초점을 맞춘 현미경 이미지를 형성합니다.
분리된 래트 기관 루멘을 밝은 필드 또는 형광으로 시각화하려면 생물반응기를 이미징 단계에 놓습니다. 다음으로, 갓 제조된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 또는 CFSE 용액 500 마이크로리터를 기관지 캐뉼라의 튜빙에 연결된 시린지 펌프를 통해 기관지를 통해 분당 5밀리리터의 유속으로 주입한다. CFSE 용액이 기관을 채우면 펌프를 멈추십시오.
10분 후, 시린지 펌프를 사용하여 PBS 10 밀리리터를 주입하여 기관 루멘을 세척하여 잔류 비혼입 CFSE 시약을 제거하였다. 세척 후, 녹색 렌즈의 원위 이미징 끝을 기관의 한쪽 끝에 부착 된 루어 커넥터를 통해 기관에 삽입하십시오. 그런 다음 기관 표면이 초점을 맞출 때까지 기관 내부의 녹색 렌즈를 부드럽게 움직입니다.
마이크로매니저 소프트웨어에서 밝은 필드 이미지를 캡처하려면 케이지 큐브를 통해 기관강 루멘을 백색광으로 비추십시오. 그런 다음 라이브 아이콘을 클릭하여 기관의 내강 표면을 실시간으로 표시합니다. 이미징 설정 및 노출 탭을 사용하여 노출 시간을 원하는 값으로 변경합니다.
이미지의 대비와 밝기를 조정하려면 히스토그램 및 강도 배율 창을 사용하여 대화형 히스토그램 디스플레이의 끝점에서 흑백 화살표를 이동합니다. 라이브 중지를 클릭하여 스냅 아이콘을 활성화한 다음 스냅 아이콘을 클릭하여 이미지를 고정합니다. 그런 다음 이미지를 변위된 탭으로 내보내기 설정을 사용하여 이미지를 원하는 형식으로 저장합니다.
형광 모드에서 사진 및 비디오를 얻으려면 케이지 큐브를 통해 CFSE 전용 레이저 광으로 기관 내강을 비추고 이미징 프로브를 앞뒤로 움직여 실시간으로 이미지를 획득하십시오. 사진과 비디오를 얻은 후에는 기관에서 녹색 렌즈를 부드럽게 제거하십시오. 기관지의 탈상피화를 위해, 갓 제조된 2%소듐 도데실 설페이트의 50 마이크로리터를 기관 캐뉼라를 통해 주입하여 기관 내강 상에 세제 용액의 박막을 생성한다.
점안 후, 남성 또는 여성 루어 플러그를 사용하여 생물반응기의 튜빙 연결을 닫고 생물반응기를 섭씨 37도 인큐베이터로 10분 동안 옮겨 SDS가 기관 내에 거주할 수 있도록 합니다. 점안을 한 번 반복하십시오. 두 번째 점안 후, 시린지 펌프를 통해 기관 루멘트리스를 분당 10 밀리리터의 유속으로 500 마이크로리터의 PBS로 관개함으로써 용해된 상피 및 SDS를 제거하였다.
이어서, 생물반응기를 진탕기 상에 놓아 20 헤르츠의 주파수와 0.3 밀리미터의 변위 진폭으로 기계적으로 진동시켜 기관 내강으로부터 SDS 처리된 상피 세포의 분리를 물리적으로 촉진시킨다. 기관지가 기계적으로 진동하는 동안, 기관 루멘을 통해 500 마이크로리터의 PBS를 두 번 주입하여 잔류 SDS 및 세포 파편을 제거하였다. 상피 제거 후, 그린 렌즈 이미징 장치를 이용하여 CFSE의 강도를 측정하여 상피층의 클리어런스를 평가한다.
탈상피화된 래트 기관을 준비한 후, 냉동된 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포를 섭씨 37도 수조에서 30초 동안 해동시켰다. 이어서, 혈구분석기로 세포를 계수하고, 밀리리터 당 여섯 개의 세포에 대해 10배의 농도로 다섯 배의 세포 용액을 제조하였다. 이어서, 세포를 실온에서 두 밀리리터의 100-마이크로몰 CFSE 용액으로 인큐베이션하여 형광으로 표지한다.
15분 후, 세포를 5밀리리터의 PBS로 세 번 헹구고, 이를 밀리리터당 7개의 세포에 10회 3회 최종 농도로 신선한 DMEM 배지에 재현탁시킨다. 콜라겐 I 하이드로젤의 제조 직후에, 원고에 기재된 바와 같이, 세포를 원하는 농도로 하이드로겔 용액에 첨가한다. 그 후, 세포와 겔 용액을 마이크로피펫으로 혼합하여 균일한 세포-하이드로겔 혼합물을 얻었다.
다음으로, 생물반응기 내의 기관지의 한쪽 끝을 루어 커넥터를 통해 프로그램가능한 시린지 펌프에 부착하고, 5밀리리터의 신선한 배양액을 섭씨 37도의 생물반응기 챔버로 전달하여 기관의 외부 표면을 덮는다. 이어서, 10 마이크로리터의 볼루스 세포-하이드로겔 혼합물을 생물반응기 내 탈상피화된 기관 내로 투여하여 기관 내강 상에 세포-하이드로겔 층을 생성한다. 세포 주입 후, 생물반응기를 섭씨 37도의 멸균 세포 배양 배양기에 넣고 30분 동안 겔화하기 위해 5% 이산화탄소를 넣어 겔화시킨다.
이식 된 세포의 분포를 시각화하려면 녹색 렌즈를 70 % 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 살균하고 이미징 단계에 생물 반응기를 배치하여 밝은 필드 및 형광 모드에서 사진과 비디오를 얻습니다. 세포 시딩의 30분 후에, 분당 한 밀리리터의 유속으로 기관 루멘에 한 밀리리터의 배양 배지를 주입한다. 마지막으로, 생물반응기 내의 세포-시딩된 기관을 섭씨 37도의 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양한다.
세포 배양 동안, 배지를 루멘 정적으로 유지하고, 기관 외부의 배지는 단방향 흐름을 통해 지속적으로 관류된다. 탈상피화된 기관의 밝은 필드 및 형광 이미지에서, CFSE 표지 이전에 형광 신호가 관찰되지 않았다. CFSE를 이용하여, 상피 전체에 걸쳐 균일한 형광 신호가 관찰되었다.
탈상피화 후, 형광 강도는 유의하게 감소하였고, 이는 상피의 절제를 나타낸다. 탈상피화된 기관지의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 기관 내강으로부터 의사층화된 상피의 제거, 및 기저 조직층에서 세포 및 세포외 기질, 또는 ECM 미세구조의 보존을 예시하였다. 또한, 펜타크롬 및 트리크롬 염색을 통해 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 기관 조직 구조 및 ECM 성분의 유지를 확인하였다.
상피 세포 및 콜라겐 I의 면역형광은 상피의 완전한 제거 및 상피 하부 조직 내의 콜라겐 I의 보존을 밝혀냈다. 주사 전자 현미경 사진은 천연 기관이 다중화 및 잔 세포로 채워져 있음을 나타냈다. 탈상피화된 기관에서, 기저막은 세포외 매트릭스 섬유의 메쉬 네트워크 및 상피 세포의 부재에 의해 지시된 바와 같이 노출되었다.
PBS 및 콜라겐으로 시딩시 탈상피화된 기관의 형광 이미지가 여기에 도시되어 있다. 배양 배지를 통해 시딩된 세포와 비교하여, 하이드로겔을 통해 전달된 형광 표지된 세포는 루멘을 가로질러 더 균일하게 부착된 채로 남아있었다. 세포 생존력 연구는 생존력이 세포 전달 절차에 의해 영향을받지 않았으며 90 % 이상의 세포가 생존 가능한 상태로 남아 있음을 보여주었습니다.
탈상피화 과정에서 세제의 박막을 만들고 하이드로겔을 세포의 전달 비히클로 사용하는 것은 이 프로토콜의 성공을 위한 필수적인 단계이다. 우리의 다음 연구 목표는 기능성 기도 조직이 준비 될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 실험실에서 재배 한 기도 일차 또는 줄기 세포를 탈상피화 된 기도 조직에 이식하는 것입니다.
