이 프로토콜은 일반적인 근생 선조 세포에서 파생된 엑슨을 이식하여 Duchenne의 근 위축증 마우스에서 심장 기능을 전환적으로 향상시키는 방법을 제시합니다. 외경 이식은 수령인 심혼에 있는 이영양증의 증가한 발현과 관련하여 DMD 마우스에 있는 심장 기능을 향상할 수 있습니다. 엑슨 분리, 정화 및 인트라메요카르방 이식에 적합한 방법은 듀첸의 근이영양증을 가진 마우스의 심장 기능을 향상시키기 위해 엑슨 이식의 성공에 기여합니다.
MPC 유래 엑소솜 치료는 엑소좀 매개된 정상 디스트로핀 mRNA 전달에 의한 골격 근육 기능을 향상시킬 수 있다. 이 비디오는 이식 후 외성 정제, 인트라미카르탈 엑소솜 전달 및 에코카르티오그래피를 위한 중요한 기술을 보여줍니다. 에코카르디그래피의 데모는 우리 실험실의 기술자 인 Yan Shen에 의해 수행됩니다.
이 절차를 시작하기 위하여는, 10%FBS및 항생제를 포함하는 완전한 DMEM의 20 밀리리터와 15 센티미터 배양 접시에 5백만 C2C12 세포를 종자. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음으로, 100, 000배, 섭씨 4도에서 초원심분리기 FBS에 스윙 버킷 로터를 사용하여 18시간 동안 섭씨 4도에서 엑소좀 고갈된 매체를 준비한다.
펠릿을 버리고 상체를 수집합니다. 단층 세포가 배양 접시에 80%에 도달하면 전체 DMEM을 exosome 고갈 된 매체로 대체하십시오. 48시간마다 세포 배양 접시에서 상체를 수집하기 위해 이송 파이펫을 사용하십시오.
나머지 세포를 제거하기 위해 10 분 동안 150 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 0.22 마이크로미터 필터를 통해 상체를 필터링하여 세포 이물질을 제거하고 여과된 매체를 초투명 튜브로 옮기습니다. 다음으로, 스윙 버킷 로터를 사용하여 튜브를 100, 00배, 섭씨 4도에서 120분간 사용하여 엑소좀을 침전시합니다.
PBS에서 엑소솜 함유 펠릿을 다시 중단한 다음 PBS로 전체 초투명 튜브를 채웁니다. 이 서스펜션은 100배, 00배, 섭씨 4도에서 120분 동안 오염단백질을 제거합니다. 슈퍼네티드를 버리고 PBS의 100 마이크로리터에서 엑소솜 펠릿을 재차 놓습니다.
향후 사용을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 각 마취마우스를 수술 플랫폼의 척추 위치에 고정하여 각 사지를 테이프로 고정시한다. 윗턱을 제자리에 고정시키기 위해 위니 아래에 수평으로 3-0 봉합사를 놓습니다.
다음으로, 마우스 가슴의 왼쪽에 디필 크림을 바르면 피부에서 전나무를 제거합니다. 24 게이지 카테터를 사용하여 구강을 통해 내트라큐레이션 삽관을 수행합니다. 설치류 인공호흡기를 사용하여 분당 195회 호흡속도로 실내 공기로 마우스를 환기시합니다.
70%의 알코올과 10%의 포비도네 요오드로 피부를 소독합니다. 그런 다음 왼쪽 흉골 가장자리에서 왼쪽 겨드랑이까지 10 ~ 15 mm 경사 절개를 합니다. 가위를 사용하여 가슴 전공을 자르고 가슴은 경미한 것으로 절단하십시오.
그리고 네 번째 해안 간 공간을 통해 왼쪽 토라 코타미를합니다. 흉부 구멍을 10mm 너비로 퍼지도록 리트랙터 밴드를 부드럽게 삽입하여 왼쪽 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그 후 두 개의 직선 핀셋을 사용하여 심근을 제거하십시오.
그들을 떼어 내고 마음을 드러내기 위해 리트랙터 팁 뒤에 놓습니다. 31 게이지 인슐린 바늘을 사용하여 MPC-엑소 또는 PBS intramyocardially 한 부위에 좌심실의 전방 벽에 주입한다. 그런 다음 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉부 구멍, 가슴 근육 및 피부를 순차적으로 닫습니다.
PBS 엑소솜 이식 후 2일 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취한다. 테이프를 사용하여 마우스를 supine 위치에 고정하고 왼쪽 가슴 부위에 예열 된 어쿠스틱 젤을 바르습니다. 다음으로, 에코카예피를 사용하여 좌심실 기능을 평가합니다.
좌심실의 기갑 긴 축 뷰를 2차원에서 얻은 다음 초음파 프로브를 90도 회전하여 유두 근육 수준에서 좌심실 짧은 축 뷰를 얻습니다. 그 후 M-mode 심초음파 이미지를 기록하고 왼쪽 심실 종횡확장기 직경, 좌심실 단부 수축기 부피, 좌심실 단부 확장기 부피 및 좌심실 단부 수축기 부피를 측정합니다. 마우스의 심박수는 심장 측정 기능을 위해 적어도 400 bpm을 제어해야 합니다.
엑소좀이 C2C12 세포로부터 분리되고 정제된 후, 이들의 존재는 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 확인된다. 전송 전자 현미경 이미지는 C2C12 유래 엑소좀의 밝고 둥근 모양의 소포의 형태를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 CD63 및 Tsg101을 포함한 엑소솜 마커의 존재를 확인합니다.
반투명 부종 영역은 심근내 내 주입이 성공했음을 나타내는 mdx 마우스의 좌심실의 전방 벽에 내트라모니카심을 주입한 후에 관찰된다. 디스트로핀에 대한 면역 형광 염색은 심장 MPC-엑소 전달이 mdx 심혼에 있는 dystrophin 단백질 발현을 복원하는지 결정하기 위하여 그 때 수행됩니다. dystrophin 발현의 부분적인 복원은 심근 세포의 몇몇에 있는 막 국소화로 관찰됩니다.
심장 기능은 MPC-엑소의 트랜스포이션이 mdx 마우스의 심장 기능을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해 내트라미쿄카르탈 전달 후 이틀 후 에코카르디그래피로 측정된다. MPC-엑소 치료는 PBS에 비해 내부 벽 의 움직임을 개선하는 것으로 보이며, MPC-엑소 이식이 mdx 마우스에서 심장 기능을 향상시킨다는 것을 시사합니다. 약 20도에서 팁과 31 게이지 인슐린 바늘을 사용 하 여 심근에 대부분의 엑소좀의 전달에 대 한 성공에 대 한 중요 한 심근 세포를 호스트 하는 주입 된 엑소좀의 노출을 극대화.
시술에 이어, Dystrophin 발현은 MPC 유래 엑소솜 주입 후 면역형광 염색에 의해 검출될 수 있으며 이는 심장 MPC 유래 엑소좀 전달이 dystrophin-protein 발현을 회복한다는 것을 나타낸다. 이 기술은 DNA, mRNA, lncRNA, 또는 microRNAs를 포함하여 엑소좀 운반 치료 유전 물질을 가진 심근병증 처리를 위한 도로를 포장할 것입니다.
