심근병증과 같은 신생아 질환의 경우, 유도된 만능 줄기 세포 유래 세포를 이용한 재생 요법은 엄청난 잠재력을 갖는다. 그러나, 체외 가속 세포 성장은 반응성 산소 종과 같은 축적된 대사산물에 의한 DNA 손상으로 이어집니다. 이 DNA 손상한 세포를 이식하는 것은 기관의 나쁜 이식 및 재생 귀착될 것입니다.
이식하기 전에 세포의 품질을 평가해야합니다. 여기서 우리는 줄기 세포의 DNA 손상을 평가하기 위하여 2개의 단계별 프로토콜을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 제시카 밀러, 연구원, 니킬 마르데카르, 연구원, 바산티 라자세카란, 실험실 기술자가 될 것입니다.
먼저, DNA-RNA 프리 워터 100 밀리리터에 500밀리그램의 저용 아가로즈를 배치하십시오. 아가로즈가 녹을 때까지 전자 레인지에 병을 가열합니다. 그런 다음 병은 필요할 때까지 섭씨 37도의 수조에 놓습니다.
미리 코팅된 혜성 슬라이드를 준비하려면 유리 슬라이드에 0.5% 아가로즈 몇 방울을 놓습니다. 즉시 아가로즈를 확산하여 커버슬립을 사용하여 아가로즈 코팅의 얇은 층을 형성한다. 자외선으로 인한 세포 손상을 피하기 위해 저조도 조건에서 작업하고, 10 마이크로리터의 세포 현탁액과 90 마이크로리터의 아가로즈 용액을 튜브에 혼합합니다.
아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해 튜브를 섭씨 37도 의 수조에 놓습니다. 기포를 도입하지 않고 솔루션을 혼합하고, 피펫 70 마이크로리터는 미리 코팅된 혜성 슬라이드에 자리한 자리당 70마이크로리터를 제공합니다. 파이펫 팁을 사용하여 세포 아가로즈 혼합물을 확산하여 얇은 층을 형성합니다.
슬라이드를 섭씨 4도에 15분간 놓습니다. 용기에 차가운 리시스 버퍼에 슬라이드를 완전히 잠급합니다. 용기를 1시간 동안 섭씨 4도에 어둠 안에 놓습니다.
용해 버퍼를 차가운 알칼리성 솔루션으로 교체합니다. 슬라이드가 완전히 잠겨 있는지 확인합니다. 또 다른 30 분 동안 4섭씨에서 어둠 속에서 컨테이너를 떠난 후, 수평 전기 전도 탱크에 슬라이드를 배치합니다.
슬라이드가 완전히 잠기면 탱크를 차가운 알칼리성 전기 포충제 버퍼로 채웁니다. 15~30분 동안 1볼트의 전압을 1센티미터로 바에 바치면 됩니다. 용기에 차가운 탈이온 물에 슬라이드를 완전히 잠급합니다.
2분 후, 탈이온된 물을 제거하고 신선한 탈이온수를 추가한 다음 이 단계를 두 번째로 반복합니다. 다음으로, 탈이온수를 차가운 70%에탄올로 바꿉다. 5분 후, 슬라이드를 기울이지 않고 부드럽게 제거하고 공기를 건조하게 합니다.
일단 건조되면, 각 지점에 희석 된 DNA 염료 100 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 15 분을 기다립니다. 피플루오렌스 현미경에서 FITC 필터를 사용하여 샘플 당 총 50~100개의 혜성 이미지를 가져가십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 문화 iPS 유래 심근세포.
챔버 슬라이드에서 iPS 유래 심근세포를 보려면 먼저 우물에서 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척하십시오. 잘 하면 0.25%의 1밀리리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포 분리를 위해 현미경의 밑에 접시를 확인하십시오.
그런 다음 트립신을 중지 CMM의 1 밀리리터를 추가합니다. 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기와 원심분리기에 200배나 배치합니다. 매체를 폐기하고 CMM의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 셀을 다시 일시 중지합니다.
세포를 계산하고 CMM의 1.6 밀리리터에서 2백만 개의 세포를 얻기 위해 세포 수를 조정합니다. 이제 8웰 챔버 슬라이드의 웰 당 셀 서스펜션의 200 마이크로 리터를 시드. 슬라이드를 부드럽게 눌러 셀을 우물 주위에 분산시다.
섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. iPS 유래 심근세포 독소루비신 치료의 경우, iPS 유래 심근세포 유정으로부터 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세척한다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 1마이크로몰러 독소비신으로 세포를 치료하십시오.
매체를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요. 면역 라벨링을 수행하려면 PBS로 세포를 세 번 씻고 새로 준비된 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 셀을 고정합니다.
PBS로 세포를 세척한 후, 우물당 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 가습 챔버에서 30분 동안 차단합니다. 차단 버퍼를 제거하고 1 차 항체 용액의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양 한 후 PBS로 우물을 세 번 씻으시다.
PBS를 제거하고 이차 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 어두운 가습 챔버에서 45 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 PBS로 우물을 세 번 씻으시면 됩니다.
페이드 페이드로 슬라이드를 장착하기 전에 탈이온물로 씻으십시오. 커버 글래스를 놓고 슬라이드를 섭씨 4도에 어둠 속에서 보관합니다. 공초점 현미경을 사용하여 샘플 당 무작위 필드의 3 ~ 5 개의 이미지를 가지고 이미지 분석을 진행합니다.
DNA 손상 응답 포시를 계산하려면 CellProfiler를 다운로드하고 설치하십시오. 파일, 가져오기, 파이프라인을 선택하고 puncti 감마-H2AX라는 파이프라인 파일을 선택합니다. 감마-H2AX 초점의 획득된 이미지가 포함된 폴더를 분석을 위해 입력 모듈 이미지 섹션의 파일 목록 창에 드래그 앤 드롭합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 지침을 따릅니다. 이미지에 대한 매개 변수를 설정하려면 분석을 위해 원하는 이미지를 파일 목록에 드래그합니다. 입력 모듈에서 이미지를 선택합니다.
또한 입력 모듈에서 메타데이터를 선택한 다음 이름과 유형을 선택합니다. 그룹의 경우 아니요를 선택합니다. 분석 모듈에서 작업할 경우 색상을 회색으로 선택합니다.
그런 다음 매끄러운 선택을 선택하고 기본 개체를 식별하고 다시 원활하게 선택합니다. 그런 다음 피쳐를 향상시키거나 억제한 다음 기본 개체 식별을 선택합니다. 여전히 분석 모듈에서 작업하고 관련 개체를 선택한 다음 개체를 분류한 다음 마지막으로 스프레드시트로 내보내기를 선택합니다.
왼쪽 아래 패널의 이미지를 분석하여 이미지 분석을 수행합니다. 분석이 성공적으로 완료되면 여러 이미지가 생성됩니다. 생성되어 컴퓨터의 적절한 위치에 저장되는 CSV 파일을 확인합니다.
이 파일에는 추가 분석을 위한 정량적 데이터가 포함되어 있습니다. 내 실험 이미지라고 하는 스프레드시트에서, 열 B는 최대 5개의 펑크를 갖는 핵의 수를 가지며, 열 D는 5개 이상의 펑크를 갖는 핵의 수를 가질 것이다. 컬럼 B와 D를 추가하여 총 핵 수를 가져옵니다.
모든 이미지에 대해 다음 단계를 반복하여 모든 분석 전에 내 실험 파일 이름을 변경합니다. 독소 처리 및 비처리 iPS 세포에서 혜성의 대표적인 현미경 표는 여기에서 도시된다. DNA 손상의 기저 양은 IPS 세포에서 발견되었으며, DNA 손상및 꼬리 모멘절의 일부로 표현되었습니다.
그러나, 독소 치료는 예상대로 iPS 세포에서 DNA 손상을 증가시켰으며, 혜성 분석체가 다능성 줄기 세포에서 DNA 무결성을 평가하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 감마-H2AX 면역 라벨링의 대표적인 현미경 사진은 낮은 배율과 더 높은 배율로 여기에 표시됩니다. 대조군 iPS 유래 심근세포에서, 세포의 90% 이상이 핵당 5개 미만의 DDR 포시를 가졌다.
그리고 세포의 10% 미만의 총 핵 당 6 개 이상의 DDR foci했다. 6개월 동안 배양된 iPS 유래 심근세포의 경우, 세포의 90% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR 포시를 가지고 있었으며, 세포의 총 13% 이상이 핵당 6개 이상의 DDR foci를 가졌다. 독소 처리된 iPS 유래 심근세포에서 반면, 세포의 80% 미만은 핵당 최대 5개의 DDR foci를 가졌다.
그리고 세포의 대략 24%의 총에는 핵 당 6개 이상의 DDR foci가 있었습니다. 이 데이터는 장기간 iPS 유래 심근 세포 배양 및 독소 처리가 중요한 DNA 손상을 유도한다는 것을 나타내지 않으며, 세포 이식에 적합하지 않습니다. 이 전기 포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세포 현탁액을 혼합하는 동안 변수를 피하는 것이 매우 중요합니다.
이 절차에 따라, 당신은 혜성 분석 및 다양한 유형의 세포와 면역 라벨링 절차를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 세포 이식 연구 결과에서 이용되기 전에 각종 종류의 세포가 DNA 손상을 위해 평가될 수 있게 할 것입니다.
