칸디다 면역 손상 호스트에 보급 된 곰팡이 감염의 가장 일반적인 원인입니다. 매트릭스 때문에 생물막에 완전히 침투하는 치료제의 실패는 생물막이 전통적인 치료법에 저항하는 이유 중 하나입니다. 우리의 프로토콜은 홍빛을 사용하여 광요법이 칸디다 알비칸스 생물막의 성장과 배열을 방해하는 방법을 평가합니다.
이 연구에서 사용되는 균주는 세포 외 매트릭스를 특징으로하고 광 장치가 성공적으로 다른 판자 미생물 현탁액 및 생물막에 적용되었기 때문에 적용 된 방법은 잘 확립되어 있습니다. 이 장치의 가장 큰 장점은 치료 시간 단축으로 임상 응용 프로그램에 더 눈에 띄게됩니다. 칸디다 알비칸을 배양할 때 항체를 획득할 수 있다는 것을 유의하십시오.
따라서, 7일 이상 된 식민지를 사용하지 말고, 섭씨 4도에서 플레이트를 시작하지 말고, 기존 플레이트로부터 세포를 다시 줄이지 않는 것이 중요하다. 마찬가지로, 긴장은 하룻밤 성장의 18 시간 전에 사용되어야한다. 분광계를 처음으로 사용하는 경우 먼저 단위 수로 콜로니 팜을 획득하여 광학 밀도 값과 상관관계를 맺는 것이 중요합니다.
따라서, 실험은 밀리리터당 10~7개의 세포의 초기 세포 농도에서 중간 성장 단계를 사용하기 시작할 것이다. 이러한 세포 농도는 가장 의존적이고 안정적인 물질 생물막을 제공하는 것으로 나타났다. 시작하려면, 중단 65 SDA의 그램, 로람페니콜의 리터 당 50 밀리그램으로 보충, 에 1, 000 비커에 증류수의 밀리리터.
비커를 히터에 놓고 중간을 완전히 녹입니다. 그런 다음 미디어를 유리 병으로 옮기습니다. 캡을 병에 놓지만 병을 배출할 수 있도록 완전히 나사를 놓지 마십시오.
병을 오토클레이브에 배치하여 15 PSI, 섭씨 121도에서 30분 동안 살균합니다. 약 섭씨 45도에 솔루션을 냉각합니다. 일회용 멸균 파이펫을 사용하여 잘 섞고 SDA의 파이펫 20 밀리리터를 멸균 페트리 플레이트에 넣습니다.
YNB 배지를 준비하려면 100 밀리몰라 포도당으로 보충하여 6.7 그램의 YNB와 18 그램의 덱스트로스를 비커에 1, 000 밀리리터의 초순수 수를 섞습니다. 비커에 스티어 바를 놓고 비커를 저어 접시에 넣고 섞습니다. 0.22 마이크로미터 진공 필터 시스템을 통해 배지를 걸이하여 멸균합니다.
10.4 그램의 RPMI-1640 및 34 그램의 MOPS를 1, 000 밀리리터에 초순수 수의 혼합하여 RPMI 매체를 준비하십시오. 교반기에서 열 없이 섞고 일반 수산화나트륨 1개를 추가하여 PH를 7으로 조정합니다. 0.22 마이크로미터 진공 필터 시스템을 사용하여 매체를 살균합니다.
먼저, 미생물 칸디다 알비칸스 SN 425를 주변 온도에서 해동한다. 클로람페니콜로 보충된 SDA가 함유된 이전에 준비된 페트리 요리에 대한 정지 문화의 10 마이크로리터. 페트리 요리를 섭씨 37도에서 48시간 동안 에어로비티로 배양합니다.
사전 접종을 위해 살균 된 윤활유를 사용하여 페트리 접시에서 칸디다 알비칸 의 10 식민지를 선택하고 포도당으로 보충 된 YNB 배지의 10 밀리리터를 포함하는 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 16시간 동안 37도에서 튜브를 에어로비로 배양합니다. 그런 다음, 희석을 위해 1-10 비율로 포도당으로 보충된 신선한 YNB 배지에 이 스타터 문화를 추가하여 접종을 준비합니다.
분광계를 사용하여 540 나노미터에서 초기 OD를 측정합니다. 8시간 동안 37도에서 접종을 에어로비컬하게 배양하고 최종 OD를 540 나노미터로 측정합니다. 초기 OD에서 최종 OD를 빼서 접종자의 OD가 중간 로그 성장 단계에 있는지 확인합니다.
밀리리터당 7개의 세포당 10~7개의 세포로 접종을 얻으려면, 5, 500회 G.pour를 5, 500회 G.pour를 저혈당 나트륨을 함유한 비커에 슈퍼나탄을 붓고 신선한 YNB를 추가하여 이전 부피의 절반에 접종을 농축한다. 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 접종한 밀리리터 1밀리리터를 넣습니다. 우물 바닥에 세포 접착을 허용하기 위해 90 분 동안 섭씨 37도에서 에어로브로 배양하십시오.
양성 제어 생물막에 대해 0.12%의 클로르헨시딘1밀리리터로 1분간 생물막을 치료한다. 음의 대조를 위해, 멸균의 1 밀리리터, 0.89 %의 염화 나트륨으로 1 분 동안 생물막을 치료하십시오. 그 후, 우물을 각각 2회, 1분 씩 씻고, 1밀리리터의 멸균 염화나트륨을 1밀리리터로 씻어 비부착 세포를 제거한다.
그런 다음 일관되지 않은 적색 광을 켜고 전원 계수를 사용하여 빛의 전력 밀도를 측정합니다. 평방 센티미터당 87.6 줄의 에너지 밀도 요구 사항에 따라 노출 시간을 결정합니다. 접시를 빨간 불빛 아래에 놓습니다.
샘플의 온난화를 피하기 위해 광원과 바이오필름 사이의 거리를 5밀리리터로 유지합니다. 1 분 동안 노출 한 후, 각 우물에 멸균 RPMI 매체의 1 밀리리터를 추가하고 밤에 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 아침에, RPMI 매체와 함께 6 시간 동안 동일한 세척, 가벼운 치료, 긍정적 이고 부정적인 제어 치료 및 인큐베이션을 반복합니다.
다시, 두 번 생물 막을 세척, 적색빛에 노출, 긍정적 이고 부정적인 제어 치료를 수행. 우물에서 용액을 흡인하고 RPMI 매체를 추가합니다. 48시간의 생물막 개발을 달성할 때까지 인큐베이션, 세척, 가벼운 치료 및 양성 및 음수 제어 치료를 반복합니다.
처리를 시작하려면, 매체를 버리고 멸균의 1 밀리리터, 0.89%의 염화나트륨을 우물에 추가하고 파이펫 팁을 사용하여 우물에서 생물막을 긁어버린다. 제거된 생물막을 멸균 튜브로 옮기. 멸균의 또 다른 1 밀리리터를 추가, 0.89%의 염화 나트륨을 우물에 넣습니다.
다시 긁어 내고 2 밀리리터의 총 부피, 같은 튜브에 서스펜션을 추가합니다. 생체 필름 서스펜션을 1분 동안 활발하게 소용돌이시다. CFU 분석을 위해, 각 희석에 대해 0.89%의 염화나트륨 용액의 900 마이크로리터를 함유한 마이크로 원심분리기 튜브로 생물막 서스펜션에서 0.1 밀리리터의 알리쿼터를 전송한다.
살막 용액을 10에서 음수 10에서 음4로 희석하여 식염수 용액으로 희석합니다. SDA 플레이트에 각 희석제 50 마이크로리터를 시드하고 48시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 식민지를 계산하고 수식을 적용합니다.
건성 중량 분석을 위해, 첫째로 계량하고 마이크로 원심분리기 관을 레이블. 생물막 서스펜션의 0.1 밀리리터와 절대 에탄올 1 밀리리터를 튜브에 넣고 18시간 동안 음수 섭씨 20도에 보관하십시오. 그런 다음 원심 분리기가 10 분 동안 10, 000 배 G를 원심분리합니다.
상체를 버리고 1 주일 동안 샘플을 건조기에 튜브를 놓습니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 무게를 다시 계량하고, 바이오매스 중량을 얻기 위해 뺄셈을 한다. 본 실험에서, 칸디다 알비칸스 생물막에 1분 동안 적색광을 가진 다이엠 치료 후, CFU는 염화나트륨으로 처리된 음의 대조군과 비교하여 감소되었다.
매일 치료 후 칸디다 알비칸스 생물막의 바이오매스의 결과, 홍등 처리 그룹은 염화물로 치료 양성 대조군에서 관찰된 바이오매스의 유사한 감소를 제시한 것을 보여준다. 두 그룹은 또한 서로 통계적 유사성을 보였다. 둘 다 바이오매스의 감소를 보였지만, 염화나트륨으로 처리된 부정적인 대조군과 비교하였다.
칸디다 알비칸의 열등한 양은 수용성 및 불용성 EPS로 관찰되었으며, 음의 대조군과 비교하여 양수 대조군에서 관찰되었다. 통계적으로 유의하지는 않지만 적색광의 디엠 적용시 EPS 용해성 및 EPS 불용성의 양을 수치적으로 감소시켰습니다. 음성 조절 및 적색광 처리단은 통계적 유사성을 보였다.
정확한 적용 기간을 결정하기 위해 치료를 시작하기 전에 전력 계수를 사용하여 빛의 전력 밀도를 측정합니다. 단계는 에너지 밀도가 항상 섭리계의 87.6 줄이 될 것이라는 것을 보장합니다. 이전에 인용된 수식을 사용합니다.
측정은 5밀리미터의 플레이트 병에 빛에서 동일한 것을 사용하여 이루어집니다. 광선 요법과 항진균 제 사이의 연관성은 적색광으로 전처리가 약물 적용에 이어 생물막내로의 약물 침투를 향상시키는지 확인하기 위해 연구될 수 있습니다. 매일 두 번 의 치료를 위해 우리는 실험실의 프로토콜을 조정하여 적색 광 처리 후 생존가능성, 건조 중량 및 세포 외 다당류 금액에 대한 해답을 제공하는 쉽고 재현 가능한 생물막 모델을 제공했습니다.
프로토콜은 일반적이며 약물, 기타 조명 또는 빛과 약물의 조합을 포함한 적색 광 이외에 다른 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 미생물로 작업하려면 안전 안경, 버튼 랩 코트 및 니트로 장갑과 같은 특수 장비가 필요합니다.
