이 프로토콜은 선천성 심장 결함을 진단하기 위한 고해상도 이미징 데이터를 생성하는 최첨단 방법을 설명합니다. 우리는 포괄적 인 CHD 진단을위한 연속 2D 이미지 스택 및 3D 재구성을 생성하기 위해 부검과 결합 된 비 침습적 태아 심 초음파와 감독 공초점 현미경 조직 병리학으로 기능 평가를 수행합니다. 이 방법은 선천성 심장 질환의 상세한 해부학 적 변화를 해명 할 수있을뿐만 아니라 두개골 안면 결함, 사지 및 골격 기형, 뇌 및 기타 내장 기관의 결함을 포함한 다른 기관의 구조적 선천적 결함을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다.
이러한 절차를 시연하는 것은 Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang 및 Benjamin Glennon, 우리 실험실의 모든 연구원입니다. 절차를 위해 마우스를 준비한 후 초음파 젤을 체온으로 예열하고 이미징 영역에 넉넉하게 바릅니다. 그런 다음 변환기를 수평면으로 향하게 된 복부에 놓고 화면에서 방광을 식별합니다.
방광이 확인되면 방광에서 두개골로 스캔하고 태아를 찾은 다음 크라운에서 엉덩이 길이를 측정하여 재태 연령을 결정합니다. 다음으로 컬러 도플러를 사용하여 심장에서 혈류를 분석하십시오. 내부 장기에 고정 침투를 허용하려면 집게나 해부 가위를 사용하여 측면 흉부와 복부를 절개하고 차가운 방에서 최소 24시간 동안 샘플을 고정하십시오.
그런 다음 샘플 식별, 현미경 배율 및 사진 내용을 포함한 이름으로 이미지를 저장하도록 소프트웨어를 설정합니다. 손목과 발목에 샘플을 고정합니다. 꼬리쪽으로 중앙 축을 따라 피부를 자르기 전에 집게를 사용하여 목 중앙의 피부를 들어 올리고 가위로 피부를 양쪽 겨드랑이 쪽으로 자릅니다.
그런 다음 배꼽에서 다리까지 피부를 자릅니다. 샘플을 삽입한 후 레이저 투사 위치를 화면의 표본 중앙으로 조정하고 줌 노브를 20x로 조정합니다. 해상도를 최적화하려면 게인을 1, 250V로 설정하십시오.
초점 노브를 사용하여 파란색 영역을 최대화한 다음 이미징을 위해 게인을 약 750V로 재설정합니다. 다음으로 절단 방법을 자동으로 전환합니다. 두께를 약 50마이크로미터로 설정하고 슬라이드를 실행합니다.
폐와기도가 보일 때 절단을 중지하십시오. 8-10 마이크로 미터 사이의 절단 두께를 선택하고 라이브 뷰 열기를 중지하십시오. 마이크로톰 커뮤니케이터를 열어 이미징을 시작합니다.
이미지를 수집하기 전에 임시 저장소 폴더가 비어 있는지 확인하십시오. 하드 구조가 보이지 않는 경우 이미지 수집을 중지합니다. 임시 저장된 파일을 하나의 TIFF 이미지 시리즈로 출력합니다.
3D 이미지 재구성을 위해 이미지 파일을 이미지 처리 소프트웨어로 끌어다 놓습니다. 팝업 창이 나타나면 데이터베이스에 복사할 링크 또는 파일을 선택합니다. 파일이 열리면 도구 모음에서 2D 3D 재구성 도구 메뉴를 클릭하고 3D MPR을 선택합니다.
픽셀 X 해상도 및 픽셀 Y 해상도의 경우 ECM 이미징 중에 사용되는 줌을 제공하여 이미지 해상도를 입력합니다. 슬라이스 간격에 ECM 이미징 중에 절단에 사용되는 슬라이스 두께를 입력합니다. 그런 다음 WWWL 도구를 사용하여 창 너비와 창 수준을 조정합니다.
이미지의 도구를 클릭하고 위쪽으로 드래그하여 이미지 밝기를 줄이고 아래쪽으로 드래그하여 증가시킵니다. 이미지의 도구를 클릭하고 오른쪽으로 드래그하여 이미지 대비를 줄이고 왼쪽 단어를 클릭하여 증가시킵니다. 팬 도구를 사용하여 이미지를 원하는 위치로 드래그합니다.
확대/축소 도구를 사용하여 이미지를 확대하거나 축소하고 회전 도구를 사용하여 원하는 대로 이미지를 회전합니다. 이제 첫 번째 패널의 컬러 축을 클릭하고 드래그합니다. 이 축을 회전하면 다른 두 패널의 방향이 어떻게 변경되는지 확인합니다.
세 개의 패널이 샘플의 관상, 시상 및 가로 보기를 나타낼 때까지 세 개의 패널 축을 회전합니다. 세 패널이 모두 적절하게 배치되고 방향이 지정되고 밝아지면 코로나 뷰를 나타내는 패널을 클릭합니다. 그런 다음 메뉴 표시 줄의 오른쪽에있는 동영상 내보내기를 클릭하십시오.
배치를 클릭하고 시작 및 끝 슬라이더를 드래그하여 전체 관심 영역을 포함합니다. 간격의 경우 두께와 동일 옵션을 선택하고 보기 방향을 나타내는 비디오를 저장합니다. 에코는 정상 대조군에서 뇌실 내 션트가없는 손상되지 않은 심실 중격과 정상 관련 대 동맥을 보여 주며 ECM에 의해 확인되었습니다.
정면도는 에코와 ECM 모두에서 LA, RA, LV 및 RV 간의 통신을 보여 주며 방실 중격 결손을 시사합니다. 색상 흐름은 심실 중격 결손을 나타내는 LV 및 RV를 가로 지르는 흐름을 보여줍니다. Echo와 ECM은 LV와 RV 사이에 심실 중격 결손이있는 우심실의 이중 출구를 나란히 큰 동맥으로 보여주었습니다.
지속적인 동맥 경화의 초음파 진단은 E14.5 단계에서 ECM에 의해 확인 된 두 심실을 무시하는 단일 유출로로 LV와 RV 사이의 통신을 보여줍니다. ECM 조직학에서 수집된 절편은 면역염색, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 심지어 유전형 분석 및 전사 프로파일링을 위한 핵산 추출 또는 단백질체 분석을 위한 단백질 추출을 위해 추가로 처리할 수 있습니다. 3차원 재구성의 이미지는 면적 또는 부피와 같은 정량적 경계의 평가를 위해 추가로 처리될 수 있습니다.
심혈관 해부학의 결함을 식별하기 위한 정확한 표현형은 선천성 심장 질환의 병리 메커니즘을 설명하기 위해 선천성 심장 질환의 유전자 조작 및 돌연변이 마우스 모델을 구축하는 데 필수적입니다. 이는 선천성 심장병 환자의 임상 결과를 개선하기 위한 치료법과 중재를 개발할 수 있는 잠재적인 기회로 이어질 수 있습니다.
