우리의 호모디머 PROTAC는 세레블론의 첫 번째 화학 억제제이며 탈리도마이드 유사체의 분자 메커니즘을 더욱 해명하고 Cereblon의 생리적 기능을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 PROTAC 플랫폼 기술은 추적할 수 없는 것으로 간주되는 관심 있는 단백질을 특별히 타겟팅하는 데 매우 유용할 수 있습니다. CRBN 억제만으로는 항종양 활성이 없습니다.
그러나 CRBN 분해제는 비만, 전염병 및 기타 장애에 임상적 영향을 미칠 수 있습니다. 합성은 도전적이고 PROTAC 화합물을 설계 할 때 효과적인 단백질 저하기를 생성하기 위해 최적의 링커와 부착물을 찾기가 어렵습니다. 우선, 2.46 그램의 Boc 보호 L-글루타민과 50 밀리리터의 테트라 하이드로푸란을 100 밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 넣고 1 분 동안 800 rpm에서 저어줍니다.
그런 다음 1.95 그램의 1, 1'carbonyldiimidazole 및 4-pyridine의 촉매 양을 추가합니다. 글루타리미드 화합물의 명확한 무색 용액을 얻기 위해 역류에서 10 시간 동안 교반을 계속합니다. 용액을 실온으로 식히고 회전 증발기로 용매를 제거하십시오.
에틸 아세테이트 200밀리리터에 잔류물을 재용하여 분리 깔때기에 붓습니다. 유기 층을 50 밀리리터로 세척하고 소금물 과 소금물 각각을 씻어, 나트륨 황산나트륨 위에 유기 층을 건조. 중력은 실리카 젤을 통해 용액을 걸러 건조제를 제거한 다음 실리카 젤을 에틸 아세테이트 200밀리리터로 헹구는다.
진공 하에서 여과에서 용매를 제거하여 화합물 1을 무색 고체로 얻습니다. 제품을 사용하기 전에 밤새 진공 상태에서 제품을 건조시십시오. 다음으로, 동요 바가 장착된 100밀리리터 라운드 하단 플라스크에 빙하 아세산 20밀리리터에 아세테이트 나트륨 0.50그램을 녹입니다.
1.25 그램의 3-플루오로프탈릭 무수드라이드와 글루타리미드 1.14 그램을 넣고 6시간 동안 역류에서 저어 화합물 3의 보라색 용액을 얻습니다. 혼합물을 실온으로 식힌 다음 100 밀리리터의 탈온화 물에 붓고 10분 동안 저어 화합물 3을 침전시합니다. 여과로 고체를 수집하고 물과 석유 에테르로 세척하고 진공 상태에서 2 일 동안 건조하십시오.
다음으로, 화합물 3의 0.83 그램과 건조 디메틸 설프리산화물 20 밀리리터를 50 밀리리터 슐렌크 플라스크에 넣고 2 분 동안 저어줍니다. 알파 오메가 디아민 링커 화합물 6의 0.22 그램, 그리고 1.05 N의 밀리리터를 추가, N-diisopropylethylamine의 1.05 밀리리터와 어두운 녹색 혼합물에서 Homodimer 8을 얻기 위해 18 시간 동안 90 섭씨에서 아르곤 에서 혼합물을 저어. 혼합물을 실온으로 식히고 100 밀리리터의 탈온화 된 물에 붓습니다.
에틸 아세테이트의 3개 50밀리리터 부분으로 제품을 추출하고, 유기 층을 결합하고, 물과 소금물 각각 50밀리리터로 세척합니다. 세척된 유기층을 황산나트륨 위에 건조시키고, 건조제를 걸기하고, 진공 상태에서 용매를 제거합니다. 잔류물을 최소한의 크로마토그래피 용매로 재해석하고 실리카 겔 컬럼에 적용하여 정제합니다.
형광 제품 분획을 수집하고 결합한 다음 용매를 제거하여 호모이머 8을 노란색 고체로 가져옵니다. 시작하려면 100 밀리리터 라운드 하단 플라스크에 디메틸포르마미드 25 밀리리터에 2.28 그램의 글루타리미드 1을 녹입니다. 이 용액에서 2.76 그램의 분쇄 된 탄산 칼륨을 일시 중단하십시오.
그런 다음, 20 게이지 바늘이 장착 된 주사기에 요오메탄의 0.62 밀리리터를 그립니다. 10초 동안 요오도메탄 드롭 와이즈를 추가합니다. 고무 중격으로 플라스크를 멈추고 통풍구 바늘을 추가합니다.
글루타리미드 화합물 2를 얻기 위해 실온에서 2 시간 동안 혼합물을 초음파 처리합니다. 에틸 아세테이트 50 밀리리터로 혼합물을 희석하고 분리 깔때기에 붓습니다. 플라스크를 깔때기에 헹구고 또 다른 50밀리리터의 에틸 아세테이트를 넣습니다.
제품을 작업하고 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피로 정화하여 글루타리미드 2를 무색 고체로 얻습니다. 글루타리마이드 화합물의 보존 시간을 비교1 과 2 N-메틸화가 성공했다는 것을 확인합니다. 유효성 검사를 시작하려면 다발성 골수종 세포를 관심 있는 화합물로 치료하십시오.
관련 단백질을 분리하고 단백질 분해의 웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플을 준비합니다. 그런 다음, SDS-PAGE용 젤 샌드위치를 준비하고 양극 버퍼 탱크를 pH 8.9 tris-HCl 용액으로 채웁니다. 단백질 샘플을 젤에 적재하고 70 볼트에서 20분 동안 실행한 다음 115볼트를 150분 동안 실행합니다.
다음으로, 면역 형필로팅을 위해 1x 이송 버퍼를 준비하고 조심스럽게 젤을 카세트에서 전달 버퍼로 이동하여 평형화합니다. 매우 빠르게 파열되고 구겨질 수 있기 때문에 평형을 위해 카세트에서 젤을 제거 할 때 매우 조심해야합니다. 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 순수 메탄올에 20초 이상 담그고 활성화한 다음 1x 이송 버퍼에 담급다.
젤과 멤브레인이 10분 동안 평형화하게 하십시오. 그런 다음, 웨스턴 블로팅 카세트를 조립하고 90 분 동안 180 밀리암퍼를 적용하여 단백질을 막으로 옮킵니다. 그 후 면역 염색을 통해 단백질을 시각화합니다.
세포 생존가능성에 미치는 영향을 평가하기 위해 먼저, 종자 50, 000다발성 골수종 세포는 생물학적 삼중판에서 96개의 웰 플레이트당 잘 한다. DMSO를 함유하는 100마이크로리터, 또는 화합물 8, 화합물 9 또는 포말리도마이드의 0.1, 1 또는 10 마이크로몰어를 각각 잘 첨가한다. 세포 생존성 구조 실험을 수행하기 위해 포말리도마이드의 1마이크로몰러 용액을 추가하기 전또는 후에 3시간 동안 화합물 8의 100 나노몰러 용액으로 세포를 치료하십시오.
5%의 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 24, 48 또는 96시간 동안 세포를 배양하고 발광 분석으로 세포 생존가능성을 측정합니다. 상동성 PROTAC 8의 구조는 양성자 및 탄소 NMR로 확인되었다. 이종구형 PROTAC 9는 글루타리미드 부분 내의 N-메틸화로 인해 세레블론 또는 CRBN, 결합 기능의 손실을 초래하기 때문에 부정적인 대조군으로서 합성되었다.
호모 PROTAC 8은 림프전사 인자 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 효과로 완전한 프로테오소말 CRBN 분해에 가까운 유도. 대조적으로, hetero PROTAC 9는 포말리도마이드와 유사한 행동을 보였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 프로테좀의 직접 억제제에 의해 차단될 수 있거나, 또는 네틸화 억제에 의해 간접적으로 차단될 수 있다.
화합물 8로 미리 처리된 세포는 IKZF1 및 IKZF3에 포말리도마이드의 효과에 크게 저항하였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 화합물 9 및 포말리도마이드로부터 IKZF1 및 IKZF3 분해보다 96시간 후 다발성 골수종 세포 생존가능성에 훨씬 적은 영향을 미쳤다. 화합물 8로 미리 처리된 다발성 골수종 세포는 처리되지 않은 세포 보다는 pomalidomide에 드러릴 때 현저하게 더 중대한 생존성을 가졌습니다, 화합물 8면역변색IMiD 약물 저항을 모방하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 건의하.
우리는 화합물 8 세레블론의 완전한 proteasomal 저하를 유도 발견, IKZF1 및 IKZF3 세포 생존및 증식에 부작용이 없습니다. 프로젝트 기술을 다른 대상으로 확장하는 것은 암 및 기타 질병과 관련된 단백질을 비활성화하고 추적할 가능성이 있습니다. 다른 약물과 단백질에 대 한이 기술을 적응 하는 경우, 하나는 신중 하 게 최적의 링커와 첨부 파일을 선택 하는 약물 및 단백질 대상의 분자 구조를 조사 해야.
IMIDs는 세레블론의 포인트 돌연변이 때문에 마우스에서 작동하지 않습니다, 그러나 추가 동물 연구 결과를 위해 사용될 수 있는 형질 전환 노크 마우스 모형이 존재합니다. 포말리도마이드는 매우 테라토제닉인 아날로그 탈리도마이드이기 때문에, 우리는 이 약으로 일하는 임산부를 추천하지 않습니다.
