Nossos PROTACs homodimeric são os primeiros inibidores químicos do Cereblon e podem ajudar a elucidar ainda mais o mecanismo molecular dos análogos da talidomida, bem como para investigar a função fisiológica de Cereblon. Esta nova tecnologia de plataforma PROTAC pode ser altamente útil para direcionar especificamente proteínas de interesse que de outra forma são consideradas inalcláveis. Só a inibição do CRBN não tem atividade anti-tumor.
No entanto, os degradadores do CRBN podem ter implicações clínicas na obesidade, doenças infecciosas e outros transtornos. A síntese é desafiadora e é difícil encontrar conectores e apego ideal para gerar degradadores de proteína eficazes ao projetar um composto PROTAC. Para começar, coloque 2,46 gramas de L-glutamina protegida por Boc e 50 mililitros de tetrahidrofuran em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros, e mexa a 800 rpm por um minuto.
Em seguida, adicione 1,95 gramas de 1, 1'carbonyldiimidazol e uma quantidade catalítica de 4 piridinas. Continue mexendo por 10 horas no refluxo para obter uma solução incolor clara do composto glutarimídeo. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e remova o solvente com um evaporador rotativo.
Redissolve o resíduo em 200 mililitros de acetato de etila e despeje-o em um funil separador. Lave a camada orgânica com 50 mililitros cada de água deionizada e salmoura, e seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio. A gravidade filtra a solução através do gel de sílica para remover o dessecante e, em seguida, enxágue o gel de sílica com 200 mililitros de acetato de etila.
Remova o solvente do filtrado sob vácuo para obter o composto 1 como um sólido incolor. Seque o produto sob vácuo durante a noite antes de usá-lo. Em seguida, dissolva 0,50 gramas de acetato de sódio em 20 mililitros de ácido acético glacial em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros equipado com uma barra de agitação.
Adicione 1,25 gramas de anidrido fluorofálico e 1,14 gramas de glutarimida e mexa no refluxo por seis horas para obter uma solução roxa do Composto 3. Deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente, e depois despeje-a em 100 mililitros de água desionizada e mexa por 10 minutos para precipitar o Composto 3. Recolher o sólido por filtragem, lavá-lo com água e éter de petróleo, e secá-lo sob vácuo por dois dias.
Em seguida, coloque 0,83 gramas de Composto Três e 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco em um frasco schlenk de 50 mililitros e mexa por dois minutos. Adicione 0,22 gramas de alfa ômega diamine linker Composto 6, e 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamina e mexa a mistura sob argônio a 90 graus celsius por 18 horas para obter Homodimer 8 em uma mistura verde escura. Deixe a mistura esfriar à temperatura ambiente e despeje-a em 100 mililitros de água deionizada.
Extraia o produto em três porções de 50 mililitros de acetato etílico, combine as camadas orgânicas e lave-as com 50 mililitros cada de água e salmoura. Seque a camada orgânica lavada sobre sulfato de sódio, filtre o dessecante e remova o solvente sob vácuo. Redissolve o resíduo em uma quantidade mínima de solvente de cromatografia e aplique em uma coluna de gel de sílica para purificação.
Colete as frações fluorescentes do produto, combine-as e remova o solvente para obter o Homodimer 8 como um sólido amarelo. Para começar, dissolva 2,28 gramas de Glutarimide 1 em 25 mililitros de dimetilformamida em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramas de carbonato de potássio moído nesta solução.
Em seguida, desenhe 0,62 mililitros de iodometano em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 20. Adicione o iodometano em termos de queda ao longo de 10 segundos. Roe o frasco com um septo de borracha, e adicione uma agulha de ventilação.
Sonicar a mistura por duas horas à temperatura ambiente para obter o Composto glutarimídeo 2. Diluir a mistura com 50 mililitros de acetato etílico e despeje-a em um funil separador. Enxágüe o frasco no funil com outros 50 mililitros de acetato etílico.
Trabalhe o produto e purifique-o com cromatografia de coluna de gel de sílica para obter Glutarimide 2 como um sólido incolor. Compare os tempos de retenção dos Compostos glutarimídeos 1 e 2 para confirmar que a n-metilação foi bem sucedida. Para iniciar a validação, trate múltiplas células de mieloma com os compostos de interesse.
Isole as proteínas relevantes e prepare amostras para uma análise de Western Blot da degradação da proteína. Em seguida, prepare um sanduíche de gel para SDS-PAGE e encha o tanque tampão de ânodo com uma solução de pH 8.9 tris-HCl. Carregue as amostras de proteína no gel e execute-as a 70 Volts por 20 minutos, seguidas por 115 volts por 150 minutos.
Em seguida, prepare o tampão de transferência 1x para imunoblotting e mova cuidadosamente o gel de seu para o buffer de transferência para equilibrar. Você tem que ter muito cuidado quando você remover o gel da fita para equilíbrio, porque ele pode estourar e amassar muito rapidamente. Mergulhe uma membrana de difluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro em metanol puro por pelo menos 20 segundos para ativá-lo e, em seguida, imergi-lo em 1x tampão de transferência.
Deixe o gel e a membrana equilibrarem por 10 minutos. Em seguida, monte o Western Blotting e aplique 180 miliamperes por 90 minutos para transferir as proteínas para a membrana. Depois, visualize as proteínas imunosteando.
Para avaliar os efeitos sobre a viabilidade celular, primeiro, sementes 50.000 células de mieloma múltiplo por poço de uma placa de 96 poços em triplicado biológico. Adicione a cada poço 100 microliters de mídia contendo DMSO, ou um 0.1, um ou 10 micromolar de Composto 8, Composto 9 ou pomalidomida. Para realizar o experimento de resgate de viabilidade celular, em vez disso, trate as células com uma solução de 100 nanomolars do Composto 8 por três horas, antes ou depois de adicionar uma solução micromolar de pomalidomida.
Incubar as células por 24, 48 ou 96 horas a 37 graus celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%, e medir a viabilidade celular com um ensaio luminescente. A estrutura do homodimeric PROTAC 8 foi confirmada com próton e carbono NMR. O HEterodimerico PROTAC 9 foi sintetizado como um controle negativo, pois a metilação N dentro da porção de glutarimida resulta em perda de Cereblon, ou CRBN, capacidade de ligação.
O homo PROTAC 8 induziu a degradação proteosômica do CRBN quase completa com efeitos mínimos sobre os fatores de transcrição linfoide IKZF1 e IKZF3. Em contraste, o hetero PROTAC 9 apresentou comportamento semelhante aos pomalidomides. A degradação do CRBN induzido pelo composto 8 pode ser bloqueada por um inibidor direto do proteasome, ou indiretamente bloqueada pela inibição da rede.
As células pré-tratadas com composto 8 resistiram significativamente aos efeitos da pomalidomida no IKZF1 e IKZF3. A degradação do CRBN induzido composto 8 teve muito menos efeito na viabilidade celular de mieloma múltiplo após 96 horas do que a degradação do IKZF1 e do IKZF3 do Composto 9 e pomalidomida. Múltiplas células de mieloma pré-tratadas com composto 8 apresentaram viabilidade significativamente maior quando expostas à pomalidomida do que células não tratadas, sugerindo que o Composto 8 poderia ser usado para imitar a resistência a medicamentos IMiD imunomodulatórios.
Descobrimos que o Composto 8 induz a degradação proteassômica completa do Cereblon, não tem efeitos colaterais na viabilidade e proliferação celular IKZF1 e IKZF3. Estender a tecnologia do projeto para outros alvos tem potencial para inativar e rastrear proteínas relacionadas ao câncer e outras doenças. Ao adaptar esta técnica para outras drogas e proteínas, deve-se investigar cuidadosamente as estruturas moleculares da droga e o alvo proteico para escolher os conectores e acessórios ideais.
Os IMiDs não funcionarão em camundongos por causa de uma mutação pontual no Cereblon, mas existe um modelo de rato transgênico que pode ser usado para estudos em animais. Como a pomalimida é uma talidomida analógica, que é altamente teratogênica, não recomendamos gestantes que trabalham com essas drogas.
