PROTACs homodimeric שלנו הם המעכבים הכימיים הראשונים של Cereblon ועשויים לעזור עוד יותר להחניק את המנגנון המולקולרי של אנלוגים תלידומיד, כמו גם לחקור את הפונקציה הפיזיולוגית של Cereblon. טכנולוגיית פלטפורמת PROTAC חדשה זו יכולה להיות מועילה מאוד עבור מיקוד ספציפי חלבונים של עניין כי הם נחשבים אחרת להיות בלתי ניתנים לניתוח. לעיכוב CRBN לבדו אין פעילות נגד גידולים.
עם זאת, משפילים CRBN עשוי להיות השלכות קליניות השמנת יתר, מחלות זיהומיות, והפרעות אחרות. הסינתזה מאתגרת וקשה למצוא מקשרים אופטימליים וקובץ מצורף כדי ליצור משפילי חלבון יעילים בעת תכנון תרכובת PROTAC. כדי להתחיל, מניחים 2.46 גרם של L-גלוטמין מוגן Boc ו 50 מיליליטר של tetrahydrofuran בבקבוק 100 מיליליטר עגול התחתון, ומערבבים ב 800 סל"ד במשך דקה אחת.
לאחר מכן, להוסיף 1.95 גרם של 1, 1'carbonyldiimidazole ואת כמות קטליטי של 4-פירידין. המשך ערבוב במשך 10 שעות ב reflux כדי להשיג פתרון ברור חסר צבע של תרכובת glutarimide. תן את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר, ולהסיר את הממס עם אידוי סיבובי.
להתיז מחדש את השאריות ב 200 מיליליטר של אתיל אצטט ויוצקים אותו לתוך משפך הפרדה. לשטוף את השכבה האורגנית עם 50 מיליליטר כל אחד מים ומי מלח deionized, ולייבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי. כוח המשיכה לסנן את הפתרון באמצעות ג'ל סיליקה כדי להסיר את יוב, ולאחר מכן לשטוף את ג'ל סיליקה עם 200 מיליליטר של אתיל אצטט.
הסר את הממס מן הסינון תחת ואקום כדי לקבל מורכבים 1 כמו מוצק חסר צבע. יבש את המוצר תחת ואקום לילה לפני השימוש בו. לאחר מכן, להמיס 0.50 גרם של נתרן אצטט ב 20 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית בבקבוק 100 מיליליטר עגול למטה מצויד בר ערבוב.
מוסיפים 1.25 גרם של 3-פלואורופתאלית anhydride ו 1.14 גרם של glutarimide ומערבבים reflux במשך שש שעות כדי להשיג פתרון סגול של מתחם 3. תן את התערובת להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשפוך אותו לתוך 100 מיליליטר של מים deionized ומערבבים במשך 10 דקות כדי לזרז מתחם 3. לאסוף את המוצק על ידי סינון, לשטוף אותו עם מים ואתר נפט, ולייבש אותו תחת ואקום במשך יומיים.
לאחר מכן, מניחים 0.83 גרם של תרכובת שלוש ו -20 מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד יבש בבקבוק שלנק 50 מיליליטר ומערבבים במשך שתי דקות. הוסף 0.22 גרם של אלפא אומגה דיאמין מקשר תרכובת 6, ו 1.05 מיליליטר של N, N-diisopropylethylamine ומערבבים את התערובת תחת ארגון ב 90 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות כדי לקבל Homodimer 8 בתערובת ירוקה כהה. תן את התערובת להתקרר לטמפרטורת החדר ויוצקים אותו לתוך 100 מיליליטר של מים deionized.
מוציאים את המוצר לשלוש מנות 50 מיליליטר של אתיל אצטט, מערבבים את השכבות האורגניות ושוטפים אותן עם 50 מיליליטר כל אחד מהמים והמים. יבש את השכבה האורגנית שטופה על נתרן גופרתי, לסנן את התייבשות ולהסיר את הממס תחת ואקום. לגלות מחדש את השאריות בכמות מינימלית של ממיס כרומטוגרפיה ולהחיל על עמודת ג'ל סיליקה לטיהור.
לאסוף את שברי המוצר פלואורסצנטי, לשלב אותם, ולהסיר את הממס כדי להשיג Homodimer 8 כמו מוצק צהוב. כדי להתחיל, להמיס 2.28 גרם של Glutarimide 1 ב 25 מיליליטר של dimethylformamide בבקבוק 100 מיליליטר עגול למטה. להשעות 2.76 גרם של אשלגן פחמתי טחונים בתסומה זו.
לאחר מכן, לצייר 0.62 מיליליטר של iodomethane לתוך מזרק מצויד מחט 20-מד. מוסיפים את טיפת iodomethane חכם במהלך 10 שניות. פקק את הבקבוק עם מחיצת גומי, ולהוסיף מחט אוורור.
Sonicate את התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לקבל תרכובת גלוטרימיד 2. מדללים את התערובת עם 50 מיליליטר של אתיל אצטט ויוצקים אותו לתוך משפך הפרדה. שוטפים את הבקבוק לתוך המשפך עם עוד 50 מיליליטר של אתיל אצטט.
לעבוד את המוצר ולטהר אותו עם כרומטוגרפיה עמודה ג'ל סיליקה כדי להשיג Glutarimide 2 כמו מוצק חסר צבע. השווה את זמני השמירה של תרכובות גלוטרימיד 1 ו- 2 כדי לאשר כי N-מתילציה הצליחה. כדי להתחיל את האימות, לטפל בתאי מיאלומה נפוצה עם תרכובות של עניין.
לבודד את החלבונים הרלוונטיים, ולהכין דגימות לניתוח כתם מערבי של השפלת חלבון. לאחר מכן, להכין כריך ג'ל עבור SDS-PAGE ולמלא את מיכל חיץ אנודה עם פתרון pH 8.9 טריס-HCl. לטעון את דגימות החלבון לתוך הג'ל ולהפעיל אותו ב 70 וולט במשך 20 דקות, ואחריו 115 וולט במשך 150 דקות.
לאחר מכן, הכינו חיץ העברה של פי 1 לאימונובלוט והזיזו בזהירות את הג'ל מהקלטת שלו למאגר ההעברה כדי לצייד. אתה צריך להיות זהיר מאוד כאשר אתה מסיר את הג'ל מן הקלטת עבור שיווי משקל, כי זה יכול להתפוצץ להתפורר מהר מאוד. לטבול קרום פוליווינילידין דיפלואוריד 0.45 מיקרומטר במתנול טהור למשך 20 שניות לפחות כדי להפעיל אותו, ולאחר מכן לטבול אותו במאגר העברה 1x.
תן את הג'ל ואת קרום שיווי משקל במשך 10 דקות. לאחר מכן, להרכיב את הקלטת המערבית Blotting ולהחיל 180 מיליאמפר במשך 90 דקות כדי להעביר את החלבונים לממברנה. לאחר מכן, לדמיין את החלבונים על ידי immunostaining.
כדי להעריך את ההשפעות על הכדאיות של התא, הראשון, זרע 50, 000 תאי מיאלומה נפוצה ל הבאר של צלחת 96 גם טריליקט ביולוגי. הוסף לכל באר 100 מיקרוליטרים של מדיה המכילים DMSO, או 0.1, אחד או 10 מיקרומולר של מתחם 8, מתחם 9 או פומלידומיד. כדי לבצע ניסוי הצלת כדאיות התא, במקום לטפל בתאים עם פתרון 100 nanomolar של מורכבים 8 במשך שלוש שעות, לפני או אחרי הוספת פתרון micromolar אחד של pomalidomide.
הדגירה את התאים במשך 24, 48, או 96 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה 5%פחמן דו חמצני, ולמדוד את הכדאיות התא עם עלייה זוהרת. המבנה של פרוטק הומודימרי 8 אושר עם פרוטון ופחמן NMR. פרוטאק 9 הטרודימרי היה מסונתז כפקד שלילי, כמו N-מתילציה בתוך החלק glutarimide תוצאות אובדן של Cereblon, או CRBN, יכולת מחייבת.
הומו PROTAC 8 המושרה כמעט השפלה CRBN פרוטאוזומלי מלא עם השפעות מינימליות על גורמי שעתוק הלימפה IKZF1 ו IKZF3. לעומת זאת, ההטרו PROTAC 9 הראה התנהגות דומה פומלידומידים. תרכובת 8 המושרה CRBN השפלה יכול להיחסם על ידי מעכב ישיר של proteasome, או בעקיפין נחסם על ידי עיכוב netylation.
תאים שטופלו מראש עם תרכובת 8 התנגדו באופן משמעותי את ההשפעות של pomalidomide על IKZF1 ו IKZF3. תרכובת 8 המושרה CRBN השפלה היה הרבה פחות השפעה על הכדאיות התא מיאלומה נפוצה לאחר 96 שעות מאשר השפלה IKZF1 ו IKZF3 ממתחם 9 ו pomalidomide עשה. תאי מיאלומה נפוצה שטופלו מראש עם תרכובת 8 היו בעלי כדאיות גבוהה יותר באופן משמעותי כאשר נחשפו pomalidomide מאשר תאים מטופלים, מה שמרמז כי מורכבים 8 יכול לשמש כדי לחקות אימונומודולטורי IMiD עמידות לתרופות.
מצאנו כי תרכובת 8 גורמת השפלה פרוטאסומאלית מלאה של Cereblon, אין תופעות לוואי על IKZF1 ו IKZF3 הכדאיות התא והתפשטות. הרחבת טכנולוגיית הפרויקט ליעדים אחרים יש פוטנציאל להשבית ומעקב אחר חלבונים הקשורים לסרטן ומחלות אחרות. בעת התאמת טכניקה זו עבור תרופות וחלבונים אחרים, יש לחקור בזהירות את המבנים המולקולריים של התרופה ואת יעד החלבון כדי לבחור את הקישורים וההחזקות האופטימליים.
ה-IMIDs לא יפעלו בעכברים בגלל מוטציה נקודתית בסרבלון, אך קיים מודל עכבר מהונדס שניתן להשתמש בו למחקרים נוספים בבעלי חיים. כמו pomalidomide הוא תלידומיד אנלוגי, וזה מאוד טרטוגני, אנחנו לא ממליצים לנשים בהריון לעבוד עם תרופות אלה.
