Наши гомодимерные ПРОТАК являются первыми химическими ингибиторами Цереблона и могут способствовать дальнейшему выяснению молекулярного механизма аналогий талидомида, а также исследованию физиологической функции Цереблона. Эта новая технология платформы PROTAC может быть очень полезна для конкретного таргетинга белков, представляющих интерес, которые в противном случае считаются неопровержимыми. Ингибирование CRBN само по себе не имеет противоопухоевых действий.
Тем не менее, CRBN деградаторы могут иметь клинические последствия в ожирении, инфекционных заболеваний и других расстройств. Синтез является сложной задачей, и трудно найти оптимальные связующие звенья и привязанности для создания эффективных деградаторов белка при проектировании соединения PROTAC. Для начала поместите 2,46 грамма защищенного Boc L-глутамина и 50 миллилитров тетрагидрофурана в 100-миллилитровую колбу с круглым дном и перемешайте при 800 об/мин в течение одной минуты.
Затем добавьте 1,95 грамма 1, 1'carbonyldiimidazole и каталитическое количество 4-пиридина. Продолжить перемешивание в течение 10 часов в рефлюкс, чтобы получить четкий бесцветный раствор глутаримида соединения. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и удалите растворитель с помощью роторного испарителя.
Переделить остатки в 200 миллилитров этилового ацетата и вылить его в разделительную воронку. Вымойте органический слой с 50 миллилитров каждый из деионизированной воды и рассола, и высушить органический слой над сульфатом натрия. Гравитация фильтровать раствор через кремнезем гель для удаления desiccant, а затем промыть кремнезем гель с 200 миллилитров этилового ацетата.
Удалите растворитель из фильтрата под вакуумом, чтобы получить соединение 1 в качестве бесцветного твердого тела. Высушите продукт под вакуумом на ночь перед его использованием. Затем растворите 0,50 грамма ацетата натрия в 20 миллилитров ледниковой уксусной кислоты в 100-миллилитровой колбе круглого дна, оснащенной батончиком для перемешивания.
Добавьте 1,25 грамма 3-фторофталового ангидрида и 1,14 грамма глутаримида и перемешайте при рефлюксе в течение шести часов, чтобы получить фиолетовый раствор соединения 3. Пусть смесь остыть до комнатной температуры, а затем залить его в 100 миллилитров деионизированной воды и перемешать в течение 10 минут, чтобы осадки соединения 3. Соберите твердое тело путем фильтрации, промыть его водой и эфиром нефти, и высушить его в вакууме в течение двух дней.
Затем поместите 0,83 грамма соединения 3 и 20 миллилитров сухого диметилфоксида в 50-миллилитровую колбу Шленка и перемешайте в течение двух минут. Добавить 0,22 грамма альфа-омега диамина linker соединение 6, и 1,05 миллилитров N, N-diisopropylethylamine и перемешать смесь под аргоном при 90 градусов по Цельсию в течение 18 часов, чтобы получить Homodimer 8 в темно-зеленой смеси. Дайте смеси остыть до комнатной температуры и вылейте ее в 100 миллилитров деионизированной воды.
Извлеките продукт в три 50 миллилитров порций этилового ацетата, объедините органические слои и помойте их по 50 миллилитров воды и рассола. Высушите промытый органический слой над сульфатом натрия, отфильтруните десикант и удалите растворитель под вакуумом. Redissolve остатков в минимальном количестве хроматографии растворителя и применять к колонке кремнезема гель для очистки.
Соберите флуоресцентные фракции продукта, объединить их, и удалить растворитель, чтобы получить Homodimer 8, как желтый твердый. Для начала растворите 2,28 грамма глутаримида 1 в 25 миллилитров диметилформамида в 100-миллилитровой колбе круглого дна. Приостановить 2,76 грамма измельченного карбоната калия в этом растворе.
Затем нарисуйте 0,62 миллилитров идометанов в шприц, оснащенный иглой 20-го калибра. Добавьте iodomethane падение мудрый в течение 10 секунд. Остановите колбу с резиновой перегородкой и добавьте вентиляционную иглу.
Sonicate смесь в течение двух часов при комнатной температуре, чтобы получить Glutarimide соединение 2. Разбавить смесь 50 миллилитров этилового ацетата и вылить его в сепаральную воронку. Промыть колбу в воронку еще 50 миллилитров этилового ацетата.
Работа до продукта и очистить его с кремнезема гель колонки хроматографии для получения glutarimide 2 в качестве бесцветного твердого тела. Сравните время удержания глутаримидных соединений 1 и 2, чтобы подтвердить, что N-метилирование было успешным. Чтобы начать проверку, лечить несколько клеток миеломы с соединениями интереса.
Изолировать соответствующие белки и подготовить образцы для западного анализа Blot деградации белка. Затем приготовьте сэндвич с гелем для SDS-PAGE и заполните анодный буферный бак раствором pH 8.9 tris-HCl. Загрузите образцы белка в гель и запустите его на 70 вольт в течение 20 минут, а затем 115 вольт в течение 150 минут.
Затем подготовь 1x буфер передачи для иммуноблотинга и осторожно переместите гель из кассеты в буфер передачи для эквилибрата. Вы должны быть очень осторожны, когда вы удалите гель из кассеты для эквилибрации, потому что он может лопнуть и скомкать очень быстро. Погрузите 0,45 микрометровую поливинилидную дифторидовую мембрану в чистый метанол в течение не менее 20 секунд, чтобы активировать его, а затем погрузите его в 1x буфер передачи.
Пусть гель и мембрана эквилибрировать в течение 10 минут. Затем соберите западную кассету Blotting и нанесите 180 миллиамперов в течение 90 минут, чтобы перенести белки на мембрану. После этого визуализируете белки с помощью иммуностимулятора.
Чтобы оценить влияние на жизнеспособность клеток, во-первых, семена 50000 клеток множественной миеломы на колодец 96 пластины в биологической тройной. Добавьте к каждому колодец 100 микролитров средств массовой информации, содержащих DMSO, или 0,1, один или 10 микромоляров соединения 8, соединения 9 или помалидомида. Для выполнения эксперимента по спасению жизнеспособности клеток, вместо этого лечить клетки с 100 наномолярный раствор соединения 8 в течение трех часов, либо до или после добавления одного микромолярского раствора помалидомида.
Инкубировать клетки в течение 24, 48, или 96 часов при 37 градусах по Цельсию в атмосфере 5%углекислого газа, и измерить жизнеспособность клеток с люминесцентным анализом. Структура гомодимерного PROTAC 8 была подтверждена протонной и углеродной ЯМР. Гетеродимерный PROTAC 9 был синтезирован как отрицательный контроль, так как N-метилирование в части глутаримида приводит к потере Цереблона, или CRBN, связывающей способности.
Гомо PROTAC 8 индуцированных вблизи полной протеосомной деградации CRBN с минимальным воздействием на лимфоидные транскрипционные факторы ИКЗФ1 и ИКЗФ3. В отличие от этого, гетеро PROTAC 9 показал поведение, похожее на помалидомиды. Соединение 8 индуцированной деградации CRBN может быть заблокировано прямым ингибитором протеасомы, или косвенно заблокировано ингибированием нетилирования.
Клетки, предварительно обработанные соединением 8, значительно сопротивлялись воздействию помалидомида на ИКЗФ1 и ИКЗФ3. Соединение 8 индуцированной деградации CRBN было гораздо меньше влияния на жизнеспособность клеток множественной миеломы после 96 часов, чем деградация ИКЗФ1 и ИКЗФ3 от соединения 9 и помалидомида сделал. Несколько клеток миеломы, предварительно обработанных соединением 8, имели значительно большую жизнеспособность при воздействии помалидомида, чем необработанные клетки, что позволяет предположить, что соединение 8 может быть использовано для имитации иммуномодулирующих IMiD лекарственной устойчивости.
Мы обнаружили, что соединение 8 индуцирует полную протеасомную деградацию Цереблона, не имеет побочных эффектов на жизнеспособности и пролиферации клеток ИКЗФ3. Распространение технологии проекта на другие цели имеет потенциал для инактивации и отслеживания белков, связанных с раком и другими заболеваниями. При адаптации этого метода для других препаратов и белков, следует тщательно исследовать молекулярные структуры препарата и цели белка, чтобы выбрать оптимальные связующим звенья и вложения.
IMiDs не будет работать у мышей из-за точечных мутаций в Цереблоне, но существует трансгенная модель мыши, которая может быть использована для дальнейших исследований на животных. Поскольку помалидомид является аналогом талидомида, который является высокотератогенным, мы не рекомендуем беременным женщинам, работающим с этими препаратами.
