I nostri PROTAC omodimerici sono i primi inibitori chimici di Cereblon e possono aiutare a chiarire ulteriormente il meccanismo molecolare degli analoghi di talidomide, nonché a studiare la funzione fisiologica di Cereblon. Questa nuova tecnologia di piattaforma PROTAC può essere molto utile per indirizzare specificamente le proteine di interesse che sono altrimenti considerate non tracciabili. L'inibizione del CRBN da sola non ha attività antitumorata.
Tuttavia, i degradanti CRBN possono avere implicazioni cliniche in obesità, malattie infettive e altri disturbi. La sintesi è impegnativa ed è difficile trovare linker e attaccamenti ottimali per generare efficaci degradatori proteici durante la progettazione di un composto PROTAC. Per iniziare, posizionare 2,46 grammi di L-glutammina protetta da Boc e 50 millilitri di tetraidrofurano in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri e mescolare a 800 giri/min per un minuto.
Quindi, aggiungere 1,95 grammi di 1, 1'carbonildiimidazolo e una quantità catalitica di 4-piridina. Continuare a mescolare per 10 ore a reflusso per ottenere una soluzione limpida e incolore di composto glutarimide. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e rimuovere il solvente con un evaporatore rotante.
Riassolvere il residuo in 200 millilitri di acetato di etile e versarlo in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia deionizzata e asciugare lo strato organico sul solfato di sodio. Filtrare la soluzione per gravità attraverso il gel di silice per rimuovere l'essiccante, quindi sciacquare il gel di silice con 200 millilitri di acetato di etile.
Rimuovere il solvente dal filtrato sotto vuoto per ottenere il composto 1 come solido incolore. Asciugare il prodotto sotto vuoto durante la notte prima di utilizzarlo. Successivamente, sciogliere 0,50 grammi di acetato di sodio in 20 millilitri di acido acetico glaciale in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri dotato di una barra di agitazione.
Aggiungere 1,25 grammi di anidride 3-fluoroftalica e 1,14 grammi di glutarimide e mescolare a reflusso per sei ore per ottenere una soluzione viola del composto 3. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente, quindi versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata e mescolare per 10 minuti per precipitare il composto 3. Raccogliere il solido per filtrazione, lavarlo con acqua ed etere di petrolio e asciugarlo sotto vuoto per due giorni.
Quindi, mettere 0,83 grammi di composto tre e 20 millilitri di solfossido di dimetile secco in un pallone Schlenk da 50 millilitri e mescolare per due minuti. Aggiungere 0,22 grammi di legame alfa omega diammina Composto 6 e 1,05 millilitri di N, N-diisopropiletilammina e mescolare la miscela sotto argon a 90 gradi celsius per 18 ore per ottenere Homodimer 8 in una miscela verde scuro. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente e versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata.
Estrarre il prodotto in tre porzioni da 50 millilitri di acetato di etile, unire gli strati organici e lavarli con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia. Asciugare lo strato organico lavato sul solfato di sodio, filtrare l'essiccante e rimuovere il solvente sotto vuoto. Riissolvere il residuo in una quantità minima di solvente cromatografico e applicare su una colonna di gel di silice per la purificazione.
Raccogliere le frazioni di prodotto fluorescenti, combinarle e rimuovere il solvente per ottenere Homodimer 8 come solido giallo. Per iniziare, sciogliere 2,28 grammi di glutarimide 1 in 25 millilitri di dimetilformamide in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri. Sospendere 2,76 grammi di carbonato di potassio macinato in questa soluzione.
Quindi, disegnare 0,62 millilitri di iodometano in una siringa dotata di un ago calibro 20. Aggiungi l'iodometano per quanto riguarda il drop nel corso di 10 secondi. Fermare il pallone con un setto di gomma e aggiungere un ago di sfiato.
Sonicare la miscela per due ore a temperatura ambiente per ottenere glutarimide composto 2. Diluire la miscela con 50 millilitri di acetato di etile e versarla in un imbuto separatore. Risciacquare il pallone nell'imbuto con altri 50 millilitri di acetato di etile.
Lavorare il prodotto e purificarlo con cromatografia a colonna di gel di silice per ottenere la glutarimide 2 come solido incolore. Confrontare i tempi di ritenzione dei composti glutarimide 1 e 2 per confermare che la metilazione N ha avuto successo. Per iniziare la convalida, trattare più cellule del mieloma con i composti di interesse.
Isolare le proteine rilevanti e preparare campioni per un'analisi western Blot della degradazione proteica. Quindi, preparare un sandwich di gel per SDS-PAGE e riempire il serbatoio del buffer anodo con una soluzione di pH 8.9 tris-HCl. Caricare i campioni proteici nel gel ed eseguito a 70 Volt per 20 minuti, seguito da 115 volt per 150 minuti.
Quindi, preparare un buffer di trasferimento 1x per l'immunoblotting e spostare attentamente il gel dalla sua cassetta al buffer di trasferimento per equilibrare. Devi stare molto attento quando rimuovi il gel dalla cassetta per l'equilibrazione, perché può scoppiare e accartocciarsi molto rapidamente. Immergere una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,45 micrometri in metanolo puro per almeno 20 secondi per attivarla, quindi immergerla in un buffer di trasferimento 1x.
Lasciare equilibrare il gel e la membrana per 10 minuti. Quindi, assemblare la cassetta western blotting e applicare 180 milliampere per 90 minuti per trasferire le proteine alla membrana. Successivamente, visualizzare le proteine immunosottenendo.
Per valutare gli effetti sulla vitalità cellulare, in primo luogo, seme 50.000 cellule multiple di mieloma per pozzo di una piastra di 96 po 'in tripliceto biologico. Aggiungere a ciascun pozzo 100 microlitri di supporti contenenti DMSO, o uno 0,1, uno o 10 micromolare di composto 8, composto 9 o pomalidomide. Per eseguire l'esperimento di salvataggio della vitalità cellulare, trattare invece le cellule con una soluzione nanomolare 100 di composto 8 per tre ore, prima o dopo aver aggiunto una soluzione micromolare di pomalidomide.
Incubare le cellule per 24, 48 o 96 ore a 37 gradi celsius in un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e misurare la vitalità cellulare con un saggio luminescente. La struttura del PROTAC 8 omodimerico è stata confermata con NMR protonico e carbonio. Heterodimeric PROTAC 9 è stato sintetizzato come un controllo negativo, poiché la metilazione N all'interno della porzione di glutarimide comporta una perdita di cereblon, o CRBN, capacità di legame.
L'homo PROTAC 8 ha indotto una degradazione CRBN proteosomica quasi completa con effetti minimi sui fattori di trascrizione linfoide IKZF1 e IKZF3. Al contrario, l'etero PROTAC 9 ha mostrato un comportamento simile ai pomalidomidi. La degradazione crbn indotta dal composto 8 potrebbe essere bloccata da un inibitore diretto del proteasome, o indirettamente bloccata dall'inibizione della netilazione.
Le cellule pretrattate con il composto 8 hanno resistito significativamente agli effetti del pomalidomide su IKZF1 e IKZF3. La degradazione CRBN indotta dal composto 8 ha avuto molto meno effetto sulla vitalità della cellula del mieloma multiplo dopo 96 ore rispetto alla degradazione IKZF1 e IKZF3 dal composto 9 e dal pomalidomide. Più cellule del mieloma pretrattate con il composto 8 avevano una vitalità significativamente maggiore se esposte al pomalidomide rispetto alle cellule non trattate, suggerendo che il composto 8 poteva essere usato per imitare la resistenza ai farmaci immunomodulatori IMiD.
Abbiamo scoperto che il composto 8 induce la completa degradazione proteasomale di Cereblon, non ha effetti collaterali sulla vitalità e proliferazione cellulare IKZF1 e IKZF3. L'estensione della tecnologia del progetto ad altri obiettivi ha il potenziale per inattivare e rintracciare le proteine legate al cancro e ad altre malattie. Quando si adatta questa tecnica per altri farmaci e proteine, si dovrebbero indagare attentamente le strutture molecolari del farmaco e il bersaglio proteico per scegliere i linker e gli allegati ottimali.
Gli IMID non funzioneranno nei topi a causa di una mutazione puntile nel Cereblon, ma esiste un modello transgenico di topo knock-in che può essere utilizzato per ulteriori studi sugli animali. Poiché la pomalidomide è una talidomide analogica, che è altamente teratogena, non consigliamo alle donne incinte di lavorare con questi farmaci.
