여기서 우리는 짧은 핵 RNA를 Cajal 바디에게 불린 핵 구조물로 현지화하기 위하여 필수적인 RNA 순서를 검출하기 위하여 형광표시 RNA의 미세 주입을 적용했습니다. 이 기술은 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 레이블을 지정하고 추적하기가 어려운 짧은 RNA에 적용할 수 있습니다.
둘째, 상이한 서열의 신속한 선별을 허용하고 RNA 국소화에서 그들의 역할을 시험할 수 있다. 12밀리미터에 미세 주입, 씨앗 HeLa 또는 다른 부착 세포 전에 12 밀리미터 커버립은 미세 주입 시 50 %의 합류에 도달합니다. 먼저, 준비된 커버슬립을 페트리 접시의 중앙에 놓고 셀과 2밀리미터의 배양 매체를 추가합니다.
다음 날, 세포 채워진 페트리 접시를 현미경 단계에 놓습니다. 마이크로 로더를 사용하여, 바늘에 snRNA 혼합물의 3 마이크로 리터를로드하고 페트리 접시의 표면에 대하여 45도의 각도로 마이크로 인젝터의 홀더에 바늘을 설치합니다. 바늘을 찾기 위해 10배 장거리 목표를 사용합니다.
먼저, 인젝터에 속도를 거칠게 설정하고 배양 배지에 닿을 때까지 바늘을 낮춥춥시다. 현미경 쌍안경을 사용하여 바늘이 배양 배지에 닿는 장소인 밝은 지점을 찾습니다. 바늘의 끝이 관찰 될 때까지 현미경으로 조사하는 동안 미세하고 더 낮은 바늘로 속도를 변경합니다.
시야 중간에 바늘을 이동하고 40배 장거리 목표로 전환합니다. 이 후 셀을 선택하고 바늘을 셀 위로 이동합니다. 세포 접촉에 대한 압력과 시간을 설정합니다.
바늘을 셀로 아래로 이동한 다음 미세 조작기의 하한을 설정합니다. 하한을 설정하는 것은 프로토콜의 가장 중요한 부분입니다. 커버슬립 표면이 완벽하지 않고 각 셀이 다르기 때문에 주입 세션 중에 하한을 여러 번 설정해야 합니다.
다음으로 바늘을 셀 위로 다시 이동하고 인젝터의 조이스틱에 있는 주입 버튼을 누릅니다. 바늘은 RNA 혼합물을 주입하기 위하여 한계가 설정된 장소로 세포 안쪽에 자동하게 움직입니다. 완료하려면 인젝터의 메뉴 버튼을 누르고 홀더에서 바늘을 제거합니다.
그런 다음 인젝터와 마이크로 조작기를 끄기 전에 인젝터에서 튜브를 분리합니다. 미세 주입 후, 이산화탄소 인큐베이터로 세포를 반환하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양. 다음으로 실온에서 PBS로 셀을 세 번 헹구는 다.
pH 6.9에서 0.1 어금니알데히드로 20분 동안 세포를 수정합니다. 그런 다음 실온 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. snRNA 국소화만 분석되면, 물에 세포를 간단히 헹구고 DAPI를 가진 마운팅 배지에 장착한다.
추가 단백질 국소화의 경우, 실온에서 5 분 동안 PBS에서 0.5 %의 Triton X-100으로 세포를 투과화하십시오. PBS로 세포를 세 번 헹구고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 적절한 1차 및 이차 항체로 얼룩지게 한다. 그런 다음 PBS로 세 번 헹구고 물에 한 번 헹구습니다.
그 후, DAPI를 가진 마운팅 배지에 셀을 장착한다. 이미지 할 준비가되면 침수 목표가 장착 된 고급 형광 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 획득하십시오. 마이크로 주입 된 세포가 확인되면, 샘플 당 200 나노 미터 Z 단계와 20 Z 섹션의 스택을 수집하고 수학 감소에 따라.
형광 신호를 정량화하려면 먼저 ImageJ의 현미경 이미지를 열고 채널을 창으로 분할합니다. 동기화창 도구로 창을 동기화합니다. 다음으로, 코일린 면역스테인링에 의해 확인된 카잘 몸 주위의 관심 영역을 그립니다.
코일린 정의 ROI에서 snRNA 신호의 강도를 측정합니다. 임의로 뉴클레오플라즘에 배치된 ROI에서 snRNA 형광의 강도를 결정한다. 측정값을 저장하고 카잘 본체 및 뉴클레오플라즘에서 RNA 신호의 비율을 계산합니다.
이 연구에서는 형광으로 표시된 snRNAs가 세포 내부의 수송을 모니터링하기 위해 마이크로 주입됩니다. SM 부위가 카잘 체증에 중요한지 여부를 테스트하기 위해 SM 부위가 부족한 스RNA는 핵으로 직접 마이크로 주입된다. 세포질내 주사는 대조군 역할을 하며 전체 길이의 snRNA는 마이크로인주사되어 긍정적인 대조군역할을 한다.
인큐베이션 후, 마이크로인주사 세포가 고정되고 카잘 체내 마커 코일린이 간접면역형광에 의해 시각화된다. 전체 길이 snRNA핵과 세포질 주사 후 카잘 바디에 축적. 대조적으로, SM 부위가 부족한 snRNA는 이 구획에 미세주입 후 세포질에 남아 있는 반면, SM 부위가 없는 스네RNA의 핵 미세주입은 이 스RNA가 핵에 남아 있으나 카잘체에 축적되지 않기 때문에 카잘 체내에서 국소화에 중요하다는 것을 보여준다.
때로는 하나의 셀룰러 구획으로의 미세 주입이 실패하고 속여 서번 70 킬로달톤은 핵과 세포질 모두에서 찾을 수 있습니다. 이 세포는 추가 분석에서 버려지립니다. 형광으로 표지된 snRNAs가 주입 전에 음의 80°C에 저장된다는 사실에도 불구하고 RNA 분해가 발생할 수 있습니다.
세포질에 주입된 열화된 snRNA는 핵으로 이송되지 않으며 세포질에서 국한된 상태를 유지한다. 이러한 snRNA를 폐기해야 하며 새로운 snRNA를 합성해야 합니다. 세포 유형에 대한 주입 및 보상 압력을 올바르게 조정하는 것이 중요합니다.
그리고 이전과 같이, 세포 주입에 대 한 정확한 하한을 설정 하는 것은 좋은 미세 주입에 대 한 필수적이다. RNA 격리 중에 사용되는 페놀 클로로폼은 위험하며 미세 주입 바늘이 날카로운 물체임을 기억하십시오. 이러한 재료를 취급할 때는 주의하십시오.
