우리의 프로토콜은 인공 호중구 세포주 모델을 사용할 필요없이 생체 내에서 종양 관련 1 차 호중구의 혈관 신생 잠재력을 평가하기위한 새로운 도구를 제공합니다. 니코티나미드 인지질 전달효소의 직접적인 억제는 종양-관련 호중구에서 종양 을 낳는 동물로의 후속 입양 전달으로 전신 독성 부작용 없이 호중구를 조작할 수 있게 한다. 우리는 다른 암 모형에 있는 잠재적인 호중구 기지를 둔 면역 요법의 연구 결과에 대한 종양 베어링 호스트로 전송한 후에 조작된 항 혈관형성 종양 관련 호중구의 치료 잠재력을 보여줄 것입니다.
동종 종양 마우스 모델을 설정하려면, 10 8- 12주 된 암컷 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위 유닛 1 녹아웃 마우스를 전기 면도기로 면도하고 70%에탄올로 피부를 소독하고, 그런 다음 PBS밀리리터 당 6개의 B16F10 흑색종 세포에 0.4 x 19밀리미터 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기에 3번 10번 로드하고, 각 면도에 후면 측면에 피하현의 100 마이크로리터를 주입합니다. 동물. 호중구-입양 전이의 경우, B16F10 흑색종 세포를 PBS의 밀리리터 농도당 6배 10으로 희석하고, NAMPT 억제제 FK866으로 치료된 호중구를 PBS 농도의 밀리리터당 5번째 세포당 6배 10으로 희석한다. 그런 다음, 치료되지 않은 또는 억제제 처리된 호중구를 1:10의 호중구-종양 비율로 혼합하고 1군당 최대 5마리의 마우스로 세포의 100마이크로리터를 피하한다.
주사 후, 단일 케이지에 최대 5개의 주입된 암컷 마우스를 배치하고 14일 동안 매일 종양 길이, 폭 및 깊이를 측정하기 위해 캘리퍼를 사용합니다. 주사 후 14 일째에, 70%에탄올로 각 주입된 동물의 피부를 소독하고 가위와 집게를 사용하여 종양을 얼음에 완전한 배지를 함유한 50밀리리터 원추형 튜브로 수확합니다. 조직학적 분석을 위해 종양을 절제하기 위해 최적의 절삭 온도 화합물에 종양을 잠그고 영하 80도에서 저장을 위해 액체 질소로 샘플을 동결한다.
단면의 날에는 저온을 사용하여 5마이크로미터 섹션을 얻기 전에 샘플을 영하 20도까지 해동합니다. 비특이적 결합에 고정한 후, 20°C에서 1시간 동안 관심있는 1차 항체를 가진 종양 조직 섹션을 얼룩지게 하고 PBS에서 3개의 세차재가 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호되는 섭씨 20도에서 DAPI와 같은 핵 염색염에 적절한 형광-컨쥬게이징이 있는 이차 항체로 세포를 얼룩지게 한다.
인큐베이션의 끝에서, 무수 장착 매체로 샘플을 장착하기 전에 빛으로부터 보호 되는 섭씨 20도에서 20 분 동안 슬라이드를 건조한 다음 각 슬라이드를 덮개 슬립으로 덮고 형광 현미경 으로 조직을 이미징하기 전에 섭씨 37도에서 1 시간 동안 마운팅 매체를 건조시키십시오. 종양 관련 호중구 절연을 위해, 멸균 6웰 플레이트의 개별 우물에 잘 5개의 종양을 넣고 멸균 가위를 사용하여 종양을 2~3mm 조각으로 다진다. 다음으로, 디스파스 콜라게나아제 d dnase 1 용액의 1밀리리터로 종양 조각을 습도가 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 45분 동안 소화하여 샘플을 15분마다 10밀리리터 주사기와 혼합합니다.
인큐베이션의 끝에서, 100 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포를 잘 15 밀리리터 튜브로 필터링하여 소화되지 않은 섬유를 제거하고 15 밀리리터의 최종 부피에 PBS를 추가합니다. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집하고 튜브 당 용해 완충제의 1 밀리리터로 적혈구를 용인한다. 혼합 후 각 튜브의 내용을 단일 15 밀리리터 튜브에 결합하여 2 분 후에 완전한 섭씨 4도 의 11 밀리리터로 반응을 멈춥춥시다.
원심 분리 후, PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 15 분 동안 Fc 블록 항체의 세 마이크로 리터와 비 특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 항 CD11b 및 Ly6G 항체 및 관심있는 다른 항체, 플러스 DAPI로 세포를 표시, 빛으로부터 보호 얼음에 30 분 인큐베이션. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 14 밀리리터에서 세포를 세척하고 얼음에 대한 신선한 완전한 중간 농도의 밀리리터 당 7 세포에 10 번 10에서 펠릿을 다시 중단한 다음, 표준 선별 프로토콜에 따라 CD11b 양성, Ly6G, 높은 DAPI 음성 호중구를 형광 활성화 셀러에 정렬하여 세포에 절연 된 세포체의 순도를 확인합니다.
체외 종양 관련 호중구 억제를 위해, 종자 1.5 배 10 다섯 번째 정렬 호중구 96-잘 U-바닥 플레이트의 두 개의 우물각각에 FK866을 추가하고 하나의 우물로 완전한 배지와 다른 우물에 혼자 완전한 배지의 동등한 부피로 100 나노 몰라의 최종 농도에 FK866을 추가한다. 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 후, PBS로 세포를 두 번 세척하고 후속 주입에 적합한 농도로 PBS에서 펠릿을 재보중단한다. NAMPT-억제제 처리 호중구는 치료되지 않은 세포에 비해 대동맥 분기 형성을 자극하는 능력이 현저히 감소한다.
또한, 억제제-처리된 항혈관신생 호중구의 피하 주사는 치료되지 않은 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위유닛 1 녹아웃 호중구로 주입된 마우스에 비해 종양 성장에 상당한 손상을 유도한다. 추출된 종양의 조직학적 검사는 치료되지 않은 녹아웃 호중구를 주입한 종양에 비해 억제제 처리된 종양 관련 호중구로 치료된 마우스로부터 분리된 종양에서 혈관신생의 현저한 억제를 더욱 확인한다. FK866 처리된 종양 관련 호중구의 특성을 평가하기 위해, 정량적인 PCR 및 웨스턴 블롯은 호중구 편광에 관여하는 세포내 통로의 활성화를 연구하기 위해 수행될 수 있다.
호중구는 수명이 짧기 때문에 가능한 한 빨리 모든 단계를 수행하고 전체 절차 중에 호중구를 차갑게 유지할 필요가 있습니다. 이 기술은 생체 내에서 종양 관련 호중구의 혈관신생 및 종양 생성 특성의 조절에 관여하는 세포 내 메커니즘 및 요인에 대한 연구를 위한 길을 열어줍니다.
