이것은 인간 유도 만능 줄기 세포를 우수한 장벽 특성, 성숙한 밀착 접합 및 중앙 초보자 시스템으로의 면역 세포 이동을 매개하는 내피 세포 부착 분자의 발현을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포로 분화할 수 있는 최초의 프로토콜입니다. EECM-BMEC 유사 세포는 완전 자가 방식으로 환자로부터 파생된 혈액 뇌 장벽 모델을 사용하여 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 면역 세포 이동을 연구할 수 있습니다. 다발성 경화증 환자에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 EECM-BMEC 유사 세포로 분화함으로써 다발성 경화증 환자의 이러한 시험관 내 모델에서 내재적 장벽 결함을 식별할 수 있었습니다.
따라서 이 문화적 방법을 통해 우리는 미래에 이러한 손상된 장벽 특성의 기초가 되는 분자 경로를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법은 혈청 형태 및 CNS로의 면역 세포 침윤이 이러한 발병기전, 예를 들어 뇌졸중 또는 신경감염에 중요한 광범위한 질병에 적용될 수 있습니다. 이 기술을 처음 시도 할 때 동일한 양의 셀 재료를 사용하십시오.
시드 밀도는 이 프로토콜의 성공의 열쇠이며 사용된 클론에 따라 조정해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 조교수 인 Kinya Matsuo가 될 것입니다. 내피 전구 세포 배양의 5일째에, 웰로부터 배지를 흡인하고, 각 웰에 1밀리리터의 해리 시약을 첨가한다.
섭씨 37도에서 6-8분 동안 플레이트를 배양합니다. 마이크로피펫을 사용하여 세포를 해리하고 특이화합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 통과시켜 10밀리리터의 DMEM/F-12 10 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 여과합니다.
소화 반응을 멈추려면 DM DMEM/F-12 10 배지를 최대 50밀리리터 표시까지 추가합니다. 철저하게 피펫을 만들고 세포 수를 계산하기 위해 10 마이크로 리터를 예약하십시오. 50 밀리리터 튜브를 200 g에서 섭씨 20 내지 25도에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화한다.
원심분리 후 상층액을 제거하고 10밀리리터의 DMEM/F-12 10 배지로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 섭씨 20 내지 25도에서 5분 동안 200g에서 원심분리하여 세포를 다시 펠렛화하였다.
그런 다음 세포 펠릿을 유동 완충액 1에 다시 현탁합니다. 다음으로, FCR 차단 시약을 1 대 100 비율로 첨가하고 5 분 동안 배양한다. 이어서, 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 표지된 CD31 항체를 200 비율로 첨가한다.
섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 어둠 속에서 30 분 동안 현탁액을 배양하십시오. 배양이 끝나면 10 밀리리터의 유동 완충액 1을 샘플에 첨가하고 CD31 양성 세포의 분획을 결정하기 위해 유세포 분석을 위해 10 마이크로 리터의 현탁액을 예약합니다. 세포를 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 5분 동안 200g에서 원심분리한다.
원심분리 후 세포를 유동 완충용액 1개로 재현탁한다. 다음으로, 세포 현탁액 100 마이크로리터당 FITC 선택 칵테일 5 마이크로리터를 첨가한다. 피펫팅으로 용액을 완전히 혼합하고 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 15분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
다음으로, 세포 현탁액 100 마이크로 리터 당 5 마이크로 리터의 자성 나노 입자를 첨가한다. 혼합물을 잘 피펫팅하고 섭씨 20-25도에서 10분 동안 암실에서 배양합니다. 세포 현탁액을 5 밀리리터 유세포 분석 튜브로 옮기고 유동 완충액 1을 첨가하여 총 부피 2.5 밀리리터를 얻는다.
그런 다음 유세포 분석 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다. 연속적인 동작으로 자석을 뒤집고 표지되지 않은 FITC CD31 항체가 포함된 세포 현탁액을 디캔팅합니다. 자석과 튜브를 거꾸로 된 위치에 2-3초 동안 유지한 다음 남은 액체를 제거합니다.
튜브를 똑바로 세우기 전에 튜브 가장자리의 물방울을 흡인하십시오. 자석에서 유세포 분석 튜브를 회수하고 2.5 밀리리터의 유동 완충액을 첨가하여 나머지 CD31 양성 세포를 세척한다. 세포를 두세 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 다시 일시 중단합니다.
그런 다음 유동 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다. 세척을 4회 이상 반복하여 FITC CD31 표지되지 않은 세포를 튜브로부터 제거하였다. 자석으로부터 유동 튜브를 제거하고, 정제된 CD31 양성 세포를 원하는 양의 적절한 배지로 재현탁한다.
현탁액의 10마이크로리터 분취량 2개를 예약하는데, 하나는 세포 계수용이고 다른 하나는 자성 활성화 후 세포 분류 샘플에서 CD31 양성 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 내피 및 비내피 세포 집단을 함유하는 6개의 웰 플레이트로부터 HECSR 배지를 제거한다. 그런 다음 각 웰에 1 밀리리터의 해리 시약을 첨가하십시오.
현미경으로 세포 형태를주의 깊게 관찰하십시오. 내피 세포가 밝고 둥글게 보이면 보통 2-5분 이내에 판 가장자리를 두드려 분리합니다. 비내피 세포는 플레이트에 부착된 상태로 유지됩니다.
마이크로피펫을 사용하여 비내피 세포를 방해하지 않고 분리된 내피 세포를 조심스럽게 수집하고 해리 시약 10밀리리터당 4밀리리터의 DMEM/F-12 10이 들어 있는 15밀리리터 또는 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 나머지 부착 된 비 내피 세포가 들어있는 웰에 HECSR 배지 2 밀리리터를 추가하여 세포 또는 SMLC와 같은 평활근을 만들고 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 내피 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
철저히 혼합하고 세포 계수를 위해 현탁액 10 마이크로 리터를 예약하십시오. 나머지 세포를 200g에서 섭씨 20-25도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 HECSR 배지 2 밀리리터를 추가하십시오.
다음에, 미리 제조된 콜라겐 코딩된 6웰 플레이트로부터 용액용 콜라겐을 제거하고, 2밀리리터의 내피 세포 현탁액을 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 플레이트를 배양합니다. claudin-5, occludin 및 VE-cadherin을 포함하는 EECM-BMEC 유사 세포 접합 분자의 면역형광 염색을 사용하여 세포 형태와 연속적이고 성숙한 접합부의 존재를 평가했습니다.
SMLC 유래 조건 배지에 희석된 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마와 같은 전염증성 사이토카인으로 챔버 슬라이드에 시딩된 EECM-BMEC 유사 세포의 자극은 ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 접착 분자의 발현을 상향 조절했습니다. 알파 평활근 액틴, 칼포닌 및 평활근 단백질 22 알파를 포함하는 평활근 세포 마커의 대표 이미지가 여기에 표시됩니다. 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마와 같은 전염증성 사이토카인을 사용한 EECM-BMEC 유사 세포의 자극은 ICAM-1, VCAM-1 및 P-셀렉틴을 포함한 여러 접착 분자의 세포 표면 발현을 상향 조절했습니다.
또한, 염증성 사이토카인을 이용한 자극은 내피 부착 분자의 발현을 상향 조절하고 EECM-BMEC 유사 세포 단층에 부착하는 면역 세포의 수 증가를 촉진합니다. EECM-BMEC 유사 세포는 혈액-뇌장벽 수준에서 병태생리학적 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 혈액-뇌장벽 안정화를 위한 새로운 치료 표적을 개발하는 데 유용한 도구로서 유망합니다.
