웰컴 트러스트는 재정 지원을 (JSY 및 KLB에 074,128의 연구 활동에 VIP 수상) 제공됩니다. RJA 의료 연구위원회 학생이기 Leica_SP2_Stacker, 시리즈로 &#39;재건&#39;에 대한 TIFFs를 가져오기 위해 사용되는 알고리즘은, Leica_tiff_sequence 그의 권한 토니 콜린스에 의해 개발 및 사용 ImageJ에 Leica SP2 TIFFs를 읽기위한 플러그인을 기반으로합니다. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg과 TurboReg은 조직의 움직임에 대한 정확한하는 데 사용되는 알고리즘은 트레이스 venaz 및 동료 (1998) 9을 기반으로합니다. Excel_writer.jar는 커트 데 보스 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html)에 의해 작성되었습니다. JNCT0.08JoVE.ijm, 입자 검출 알고리즘은 KL의 두뇌에 의해 제작되어 이전 5 세부 알고리즘을 기반으로합니다.

1 부 : 칼슘 2의 준비는 + 표시 (오레건 그린 488 BAPTA - 1 AM) <ol><li> 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 AM 가루를 소량 (50 μg)로 500 μl 병이된다. 가루로 F - 127 솔루션, 30 s에 대한 부드럽게 흔들어 40 μl Pluronic를 추가 후, 460 μl PSS를 추가, 30 S. 위해 부드럽게 흔들 최종 솔루션은 10 μm의 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 여기는, 4 x 125 픽셀 μl aliquots을 제공합니다. -20 C.에 빛을 저장하는 노출을 피하십시오 </li></ol> 2 부 : CA 2 + 로딩 <ol><li> (-20 C) 냉동실에서 칼슘 2 + 표시등 (오레건 그린 488 BAPTA - 1 AM) 제거하고 실온에서 해동 수 있습니다. </li><li> 시험관과 물 욕조에서 장소에 PSS 1 ML 가져가라. 95% O 2 / 5% 초당 나타나지 1 시경 거품의 비율로 CO 2와 버블. 버블러는 벙이나 Parafilm와 예 시험관로 확보해야합니다. </li><li> 동물의 조직을 절개하다하고, Sylgard 늘어선 페트리 접시에, 신중하게 결합 조직을 제거합니다. 없이 부드러운 근육 기관 유형의 PSS는 매 10 분을 대체되어야하며 조직은 (PSS 세 번 교체하여 예) 다음과 같은 절개를 잘 씻어해야합니다. 중이야 deferens의 경우 : 조직의 시트를 생산하는 길이 - 방법 오르간을 절단 고려하십시오. 방광의 경우 : 돔 (앞쪽에)의 상단에 방광 목 (후부)에서 길이 방향 엽니다. 8 mm 길이 1 - - 지배 근육 번들 방향으로 절단 detrusor의 등의 표면을 따라 폭 2mm, 넷 스트립, 6을 준비합니다. </li><li> 장소는 &#39;미리 예열하고 부풀어 오른&#39;PSS의 조직을 해부 했어요. </li><li> 10 μm의 오레곤 그린 488 BAPTA - 1은 시험관 오전 125 μl를 추가하고 약간 대하지, 손으로 혼합합니다. </li><li> 호일로 덮여 버블링과 휴가를, 이력서. 충분한 조직 + 표시기가 평활근 층의 조직과 두께의 크기에 따라 다릅니다 칼슘 2 걸릴 수있는 시간이 걸립니다. 예를 들면 : 120 분 (쥐 d​​etrusor, 마우스의 중이야 deferens) 70 분 (마우스 detrusor, 쥐 anococcygeus). </li></ol> 파트 3 : 현미경의 &#39;칼슘 2 + 로드된&#39;조직을 준비 주의 조직 달아은 조직의 자발적인 움직임을 (상대적으로 손상 조직의 평활근 세포의 이미지의 속성) 최소화 및 이미징에 적합한 사이트의 위치를​​ (조직의 평면 조각으로 수 있습니다 촉진하기 위하여 필요한 오히려 세 이상의 2 차원)에서 조사. <ol><li> 적어도 5 분 대한 부풀어 오른 PSS의 조직을 씻어. </li><li> 플랫 시트를 형성하는 조직을 (약간) 스트레칭, Sylgard 늘어선 준비 접시에 마운트합니다. 목적을 흠집 수 있습니다 긴 &#39;핀&#39;을 사용하지 마십시오; &#39;핀&#39;으로 25-50 μm의 직경 실버 와이어 대신 짧은 길이를 사용하여 각도로 삽입합니다. </li><li> (이 수는 superfusion이 시작 PSS에 적용되는 넓은 지역을 초래할 등) PSS는 접시의 Sylgard 늘어선 지역에서 탈출하지 않도록주의하고, 현미경 단계에 준비 접시를 놓습니다. </li><li> PSS와 준비를 superfuse하기 위해 펌프를 전환합니다. 시간 당 100 ML의 속도는 종종 고용됩니다. </li><li> 히터 장치를 전환합니다. </li><li> 준비 요리 (바닥에있는 자석에 의해 금속 스트립으로 각각 affixing)에 유입 및 유출 튜브 및 온도 프로브를 놓습니다. 유출 튜브의 끝의 높이가 PSS의 깊이를 결정합니다. 유출 사실 (이것은 때로는 처음하지 않는 등) PSS를 제거하도록주의하십시오. </li><li> 원하는 온도, 예를 들어 33-35 C.에 도달 히터 장치에서 온도를 설정 </li><li> 조직은 적어도 10 분 대한 평형 수 있습니다. </li></ol> 4 부 : 사이트의 선택 이미지 여기 조명에 노출이 표시기를 photobleach하므로 한 번에 몇 초 이상 사용하지 마십시오. <ol><li> 낮은 전력 목적으로 (10X 또는 20x) 평활근을 확인하고 모니터에 적합한 영역을 식별하는, 푸른 빛이 epifluorescence, 흥미 진진한를 사용합니다. 운동 (최소한되어야하는)와 필드에 평활근 세포의 번호에 따라 사이트를 선택하려고합니다. 밝은 &#39;구조&#39;이미지 검색 알고리즘에서 &#39;잘못된 반응&#39;의 높은 숫자를 일으킬 수 있으므로 (예) interspersed 상피 세포 또는 섬유아 세포의 다수와 함께 사이트를 피하십시오. </li><li> 높은 전력 목적 (40x)로 전환합니다. </li><li> 평활근 세포 (S)가 가로 놓여 있도록 (빠른 스캔 축에 즉, 병렬) 단계 또는 광학 축을 회전. </li></ol> 제 5 부 : 공촛점 현미경 의 세부 사항이 공촛점 현미경은 &#39;설정&#39;방법을 각 현미경 유형에 특정 있지만,주요 고려 사항은 다음과 같습니다 속도 (5 Hz의 최소 대부분의 칼슘 2 + 과도 필요합니다) 분야의 해상도와 크기 (둘 중 상장 - 오프 속도로됩니다.) 다음 프로토콜 중 일부는 Leica SP2 똑바로 공촛점 현미경에만 적용됩니다. 일반적인 프로토콜입니다 : 5 Hz에서 (256 X 256 픽셀, 약 100 X 100 μm의.)에서 취득한 100 프레임 시리즈, 또는 13.5 Hz에서 (256 X 64 픽셀, 약 100 X 25 μm의..) 스캔 머리가 이중 directionally 이동 (수집 속도를 극대화하기 위해)와 한 줄에 1,000 Hz에서에서 취득으로 설정. <ol><li> 한 &#39;에어리 디스크&#39;로 핀홀을 닫습니다. </li><li> 이 값이 밝기와 photobleaching 사이의 트레이드 오프이며 AOTF 25 35 % 사이 레이저 (488 nm의) 전원을 설정합니다. (후자는 긴 녹음 기간 동안 특정 문제가되고.) </li><li> &#39;치료&#39;최대 6 사이트 - 여섯 사이트마다 시리즈, 4를 취득. 중요한 photobleaching이 실험자이 이탈하는 원인이 될 수 있습니다하지만 그것은 같은 여섯 사이트 사전 약물 (예 : &#39;통제&#39;)과 후 약물을 모니터하는 것을 목표로하는 일반적입니다. </li><li> &#39;시간 관리&#39;가 수행되는 칼슘 2 + 이미징 필수 그것을이다. </li></ol> 6 부 : 분석을위한 준비 <ol><li> http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html : 이미지에서 J를 다운로드하고 설치합니다. 플랫폼 특정 버전을 다운로드 후, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar에서 최신 imageJ.jar 파일을 다운로드 기존 파일을 대체하여 최신 버전으로 업데이 트합니다. 애플 맥 사용자가 느리게 실행되면, 당신이 애플 (http://www.apple.com/macosx/features/java/)에서 사용할 수있는 자바 가상 머신 (JVM)의 최신 버전을 사용하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 에서 Excel_writer.jar 다운로드 : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html과 [디렉토리]&gt; 병 디렉토리 플러그인으로 설치합니다. </li><li> ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class 다음 파일을 플러그인 디렉토리에 복사합니다. 플러그인을 사용하여 이러한 스크립트를 각 설치 [메뉴]&gt; 매크로&gt; 설치 ... ImageJ의 기능을 수행합니다. </li><li> 우리는 소프트웨어 내에서 하나의 볼 &#39;영화&#39;로 각각의 시리즈를 생성하는 Leica SP2 공촛점 현미경, 소프트웨어 (Leica LCS)를 사용하지만, 개별 프레임을 저장합니다. 시리즈로 프레임을 재구성하려면 다음 단계를 따르십시오 (I 것은) 모두 &#39;프레임&#39;이 하나의 폴더 (예 : &#39;DataFolder가&gt; Tiffs&#39;)에 재건된 수 있는지 확인합니다. (2) 플러그인 [메뉴]&gt; 매크로&gt; Leica_SP2_Stacker를 선택합니다. 루트 디렉토리를 선택합니다 (예 : &#39;DataFolder&#39;). 드롭 다운 목록 (예 : &#39;Tiffs /&#39;)에서 원하는 폴더를 선택합니다. 출력 디렉터리를 선택하거나 새 (예를 들어 &#39;DataFolder&gt; 스택&#39;) 생성합니다. 스크립트는 다음 각 프레임에서 시리즈를 재구성합니다. </li></ol> 7 부 : 운동에 대한 수정 몇 군데 사이트의 운동은 잘 걸어와 최소화하고 고르게 - 늘어 조직 수 있지만, 일부 평활근의 장기 혼자 걸어주의에 의해 폐지 수없는 자발적인 수축을 나타냅니다. 여기서 우리는 일련의 시간 프레임을 일치하거나 일치 자유롭게 사용할 알고리즘의 사용을 설명합니다. <ol><li> &#39;StackReg&#39;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)와 &#39;TurboReg&#39;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/)을 다운로드합니다. </li><li> 플러그인을 사용하여 플러그인 디렉토리에 각각 설치&gt; 매크로&gt; 설치 ... </li><li> (&gt; 열기 파일 ...) 처리 될 수있는 스택을로드하고 명확하게 관심 분야를 보여주는 프레임으로 이동합니다. 다른 프레임이 참조 프레임에 정렬됩니다. </li><li> 플러그인&gt; 스택스&gt; StackReg. (예 : 번역, 단단한 몸, 줄인다 회전, Affine) 가장 효과적인 결정하기 위해 다양한 &#39;변환&#39;의 각보십시오. (자세한 세부 정보 : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> 8 부 : 입자 검출 알고리즘 각 &#39;사이트&#39;가 몇 군데 들어, 요소 칼슘 2 + 과도의 감지에 영향을 미칠 것이 달라집니다. 각 사이트 ( &#39;입자 매개 변수&#39;- 자세한 이하)의 특정 속성을 측정하여 검출하는 과정이 촉진됩니다. 그리고 &#39;셀 모서리 임계값&#39;그러므로 각 사이트에 대해 하나의 계산 &#39;에 대한 임계값은 빼는&#39;, &#39;비율에 대한 임계값. <ol><li> 플러그인 [메뉴]&gt; 매크로&gt; 설치 ... 그리고 &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;을 선택합니다. </li><li> 플러그인 [메뉴]&gt; 매크로&gt; 부하 스택 (단축키 : L). 시리즈를 선택하고 입자 매개 변수를 계산 : <ol style="list-style:none;"><li> A. 에 대한 임계값 (= 배경) 빼서 </li></ol></li><li> 당신은 &#39;배경&#39;으로 믿고있는 것들을 통해 사각형 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. </li><li> 측정 (단축키 : M). 아래 참고 의미합니다. <ol style="list-style:none;"><li> B. 비율에 대한 계산 임계값 </li></ol></li><li> 사각형을 선택셀 (들)의 광학 평면 주변 투자 수익 (ROI). </li><li> 측정 (단축키 : M). 아래 뜻과 표준 편차를 적어 둡니다. </li><li> 추가로 두 번 반복 또는 당신은 &#39;이동&#39;을 누르면 한 번에 세 개의 상자를 그릴 수 있습니다. </li><li> 계산 및 비율에 대한 임계값을 참고 = 세 가지의 값을 평균 (1 + SD / 평균) X 32 / 사이트를 복제합니다. <ol style="list-style:none"><li> C. 셀 모서리 임계값 </li></ol></li><li> 이미지&gt; 스택스&gt; Z 프로젝트 ... 프로젝션 유형 선택 : &#39;평균 강도&#39; </li><li> 이미지&gt;&gt; 임계값을 조정합니다. </li><li> 흑백을 선택합니다. </li><li> &#39;아래의&#39;정의 (어퍼 슬라이더) 제한과 해당 값 (슬라이더의 오른쪽에있는)을 내려합니다. 검은 지역에서 발생하는 이벤트만 계산됩니다. </li><li> &#39;리셋&#39;을 클릭하십시오. </li><li> 스택 (2 바로가기) Analyse </li><li> 이 단계에서 하나의 시리즈를 선택하고 &#39;첫 번째 파일&#39;을 IE와 &#39;마지막 파일은&#39;동일해야합니다. </li><li> 그리고 &#39;셀 모서리 임계값&#39;, &#39;비율에 대한 임계값&#39;빼서에 대한 임계값 &#39;의 값을 입력합니다. 자신의 기본값에서 기타 설정을 둡니다. </li><li> 이 알고리즘은 처리 시리즈가 왼쪽에 표시되며 오른쪽에 원래있는 듀얼 창에서 윈도우를 생성합니다. 조심스럽게 눈으로 보이는 이벤트를, 발견되지 않은있는 잘못된 반응과 행사의 개수를 평가하기 위해 이것을 통해서 이동합니다. 칼슘 2보다 정확한 검색을 얻으려면 + 과도 그것이 약간의 &#39;입자 매개 변수&#39;의 일부를 조정해야 할 수도 있습니다. 프로세스가 조금 &#39;를 클릭하고 미스&#39;을 보이는 첫 번째 시도에서 수 있지만, 하나는 신속하게 매개 변수가 열쇠입니다 무엇으로 느낌을 가져옵니다. </li><li> 각 시리즈의 알고리즘은 엑셀 파일을 생성하는 이벤트 감지의 세부 특성 (예 : 진폭, 면적 및 위치 등). &#39;잘못된 반응&#39;-이 엑셀 파일에서, 손으로, 제거할 수 있습니다 - 알고리즘 출력합니다 (예 : 8.17 단계) 그 이미지 파일을 검토하여 확인. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

노력은 사용 동물의 번호와 자신의 고통을 최소화하기 위해 만들어진, 모든 실험은 영국의 동물 (과학 절차) 법 1986 유럽 이사회 지침 86/09/EEC 커뮤니티에 따라 진행되었다.

형광 칼슘 2 선택 + 표시기 오레곤 그린 488 BAPTA - 1이 그것 (I)가 다른 지표 (예 : Fluo - 4 및 칼슘 그린) 1에 비해 밝은 때문에 AM은 칼슘이 같이 + 표시를 선택했다, (ii) 본 칼슘 2 생리적 변화에 민감합니다 + 농도 (3) 하중 많은 평활근 세포, 모니터로 커플링 평활근 세포를 활성화,.하는 세포내 칼슘 2 + 농도 [칼슘 2 +] 나는 (중이야의 예 : 2 deferens)와 비슷한 규모 1 K D와 함께 그러나, 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 여기는 비 ratioable 칼슘 2 + 지표이며, 등 쉽게 절대를 결정하는 데 사용할 수 없습니다 [칼슘 2 +] 나는. 또한, 그것은 또한 +있을 경우 높은 농도의 칼슘 2 버퍼와 [칼슘 2 +] 나는 높은 진폭의 변화와 포화되고 있습니다. 자발적인 수축성의 억제 평활근 기관의 자발적인 수축성이 + L - 타입 칼슘 2 일까지 + 채널 (; diltiazem 4 nifedipine 3 예가) 칼슘 2의 움직임을 차단하여 같은 pharmacologically 줄어들 수 있습니다. 이러한 약물은 크게 전체 세포 칼슘 2의 진폭 + 깜박 / 과도를 줄일됩니다. 중이야의 수축은 주로 purinergic 및 noradrenergic neurotransmission의 조합의 결과를 deferens. 이 조직에 초점 칼슘 2 + 과도 그러나, noradrenergic 수용체 봉쇄 (예 : α 1 adrenoceptor, prazosin 5) 운동은 초점 칼슘 2 + 과도 영향을주지 않고 줄일 수 수 있도록하기 위해 구별하지 않는다. 또는 수축은 wortmannin 6 마이 오신 라이트 체인 키나제 예의 억제를 통해 &#39;하류&#39;막을 수 있습니다. 결론 submicron 해상도에서 칼슘 2 + 형광 모니터링을하는 것은 신경 전달 물질 릴리스 5,7의 포스트 junctional 효과를 연구하고 칼슘 2 릴리스 + 내부 저장 (예 : &#39;불꽃&#39;8)부터 강력한 기술입니다. 방법론을 사용하여 + 과도 여기에 설명된 칼슘 2의 분석은 상업에 사용할 이미지 분석 패키지에 비해 비용 효율이고 ImageJ에 대한 사용자 지정 작성된 자바 플러그인을 통해 맞춤형 분석을 수 있습니다.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

CA 2 평활근의 + 영상은 내부 상점에서 칼슘 2 +의 출시로 막 잠재력을 변경 발생하지 않을 수 있습니다 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며, 동시에 모니터하는 여러 세포가 예를 들어, 평가할 수에 커플링 syncytial 조직. Subcellular 칼슘 2 + 과도는 평활근에서 일반적인, 아직 있기 때문에 장기에서보기 종종 다양한 분야를 통해, 그들의 확률적 발생으로 인한 문제의 정확하게 측정하기 어려운 것을 그 계약을하는 경향이. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 자동 방식으로, 이러한 이벤트의 빈도, 위치 및 진폭을 획득하고 분석하는 이미징 프로토콜과 분석 루틴 일련의 개발했습니다. 이 방법은 다른 상황에서 적용될 수 있지만, 우리 자신의 작품이 지역 purinergic 칼슘 2의 검출과 관련된 submicron 해상도 송신기 자료를 찾는 + 과도. ATP 그것은 detrusor 및 중이야의 deferens의 평활근에 P2X1 수용체에 바인딩 자율 신경에서 cotransmitter로 배포되고 있습니다. CA 2 + purinergic neuroeffector 칼슘 2 + 과도 (NCTs)의 결과로, 부드러운 근육갑니다. 초점 칼슘 2 + 과도는 전기 생리학 이상의 많은 장점을 가진 방식으로 신경 전달 물질 방출의 광학 모니터링을 허용합니다. 떨어져 크게 개선 공간적 해상도에서 광학 녹음 동시에 여러 구별 사이트에서 송신기 릴리스의 녹음을 허용하는 추가적인 장점이 있습니다. 또한, 초점 광학 비행기 유지하거나 세포 날카로운 microelectrode의 재배치보다 긴 녹화 시리즈 중에 해결하기 쉽습니다. 요약, CA 2 + 형광 이미징을위한 방법을 설명하는 세부 조직의 준비 및 데이터의 수집 및 분석. 우리는 이러한 칼슘 2 + 과도의 분석에 대한 몇 가지 스크립트의 사용을 설명합니다.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

고해상도 CA의 세부 방법<sup&gt; 2 +</sup를 포함하여 격리된 기관 내에 평활근의&gt; 영상 : 조직, 이미지 수집과 데이터 분석의 준비.

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.1K 조회수.  University of Oxford. 고해상도 CA의 세부 방법 2 + 영상 : 조직, 이미지 수집과 데이터 분석의 준비.

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

연구

생물학

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

소뇌 대동맥 파열 상해 : 효율적<em&gt; In Vivo</em&gt; 평활근 세포 증식과 내피 기능 모델

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

클릭 화학을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식 측정

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

초점 칼슘 2 + 과도 감지

초점 칼슘^{2 + 과도 감지}