이 시스템을 사용하여, 우리는 재생 세포의 전체 미세 환경이 그대로있는 인간 지방 조직의 하위 밀리미터 클러스터를 수집 할 수 있습니다. 전체 미세 혈관 시스템은 또한 손상되지 않으며, 그래서 우리는 체외 배양을 위한 생체 내 이식및 추가 특성화를 위한 세포 격리를 위해 이러한 종류의 마이크로 기관을 사용할 수 있습니다. 연구 실험실에서 시스템의 사용에 대한 주요 근거는 과정이 완전히 효소가 없으며, 미세 아키텍처를 유지하면서 인간 지방 조직의 신속하고 효율적인 처리를 허용하고 조직의 미세 혈관이 완전히 손상되지 않을 것이라는 것입니다.
그래서 우리는 진료소에서 이미 매우 유용한 것으로 입증 된 세포 치료 제품을 직접 연구 할 수 있습니다. 이 폐쇄 시스템 기술은 수확, 처리 및 재주입 정제 지방 조직 수술 에 대한 사용하기 쉬운 기술이며, 성공적으로 화장품 정형 외과, 프롬톨로지 및 산부인과에 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 조직 재생에 지방의 영향에 대한 추가 연구를 할 수 있습니다.
절차는 비앙카 베자니에 의해 입증될 것입니다, 박사 후 동료와 마리오 고메즈 살라자르에 의해, 박사 과정 학생입니다. 수확 후 16시간 이내에 무균 조건에서 작업하면 복부 성형술 샘플을 수술 용 천 위에 올려 놓고 피부가 위쪽으로 향합니다. 일회용 조직 침투 캐뉼라를 사용하여 섭씨 37도의 50~100밀리리터를 피하 지방 조직에 0.9%의 염화나트륨 용액을 주입합니다.
일회용 지방 흡입 캐뉼라에 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 연결하고 샘플 가장자리 근처의 큐탄 부위의 샘플을 잡고 조심스럽게 지방 조직에 캐뉼라를 도입하십시오. 캐뉼라가 조직 내부에 있으면 플런저를 추출하고 지방 조직 샘플 내에서 캐뉼라를 복사하여 이동합니다. 리포 포부 동안 지방 조직을 단단히 처리하는 것이 중요합니다.
충분한 지방이 수집되지 않는 경우, 추가 식염수 주입을 수행하는 것이 좋습니다. 주사기가 리포 흡혈구로 가득 차면 조직에서 캐뉼라를 조심스럽게 제거하고 총 60 밀리리터의 흡입량이 수확 될 때까지 전체 주사기를 새로운 빈 주사기로 교체하십시오. 리포 흡인의 미세 조각화를 위해 패키지에서 장치를 제거하고 메인 장치가 폐백에 연결되어 있는지 확인합니다.
폐기물 수거 백을 바닥에 놓고 밸브가 공정 단위 캡에 고정되어 있는지 확인합니다. 입력 라인의 단자 스파이크를 식염수 백에 연결하고 식염수 가방을 가공 장치보다 높게 배치하기 위해 가방 연결 포트를 관통합니다. 회로의 튜브에 연결된 5개의 클램프가 모두 열려 있는지 확인하고, 가공 장치를 수직 위치에 배치하고, 식염수 용액이 처리 장치를 채울 수 있도록 하고, 흐름이 폐백에 도달하는지 확인한다.
가공 장치를 흔들어 기포를 제거하고 파란색 캡이 위쪽으로 향하는 수직 위치에 장치를 배치합니다. 입력 라인 옆의 클램프를 닫고 리포 흡면 주사를 파란색 입력 캡의 자체 폐색 밸브에 연결하여 리포 흡인주사를 삽입합니다. 처리 장치를 수직으로 유지하여 모든 리포 흡인이 장치로 옮겨질 때까지 주사기 플런저에서 천천히 아래로 밀어 넣습니다.
모든 리포 흡인체가 주입되면 입력 클램프를 열어 식염수 흐름을 복원하고 처리 장치를 적어도 2 분 동안 격렬하게 흔들어 식염수 용액이 폐기물 백으로 유입되었는지 정기적으로 확인하십시오. 처리 장치의 식염수 용액이 투명하게 변하면 회색 캡이 있는 장치를 위쪽으로 놓고 파란색과 회색 캡 근처의 드레인에 있는 클램프를 닫습니다. 처리된 조직은 상단에 떠 있을 것입니다.
다음으로, 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 식염수 용액으로 채우고 주사기를 블루 캡의 로딩 밸브에 연결합니다. 빈 10 밀리리터 루어 잠금 주사기를 회색 캡의 밸브에 완전히 삽입한 플런저와 연결합니다. 식염수는 파란색 캡에서 처리 장치에 식염수들을 단단히 주입하여 회색 판막에 연결된 주사기가 결과적으로 처리 된 조직으로 채워지고 있는지 확인합니다.
모든 식염수주입이 발생하면 주사기를 신중하게 제거하고 모든 처리된 조직이 수집될 때까지 식염수 주입을 반복합니다. 처리가 끝나면 모든 주사기를 제거하고 모든 클램프를 닫고 식염수 가방을 분리하고 로컬 프로토콜에 따라 장치를 폐기합니다. 모든 처리된 조직이 수집되면 미세 조각된 지방 조직을 멸균 용기로 옮기고 용기에 동일한 양의 소화 배지를 추가합니다.
밀봉된 용기를 섭씨 37도의 흔들리는 수조에 넣고 분당 120회전으로 45분 간 설정하여 인큐베이션 끝에 동일한 양의 블로킹 용액으로 소화를 멈춥춥니까. 샘플을 순차적으로 필터링하여 먼저 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 200배 g에서 5분 동안 여과된 서스펜션을 원심분리합니다. 우리는 실온에서 15 분 동안 적혈구 용해 버퍼의 약 5 밀리리터에서 펠릿을 중단합니다.
동일한 양의 블로킹 솔루션으로 용액을 중지하고 40 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터링합니다. 그런 다음 원심 분리에 의해 미세 조각된 지방 조직 세포를 수집하고 우리는 계산을위한 밀가루 혼합과 신선한 차단 용액에서 펠릿을 중단합니다. 해리 및 항체 염색 후, 마이크로 단편화된 지방 세포는 세포 분석 및/또는 분류를 위한 유동 세포계로 이동될 수 있다.
수동 리포 흡인의 기계적 해리는 마이크로 혈관 네트워크를 둘러싸는 지방 세포의 집합으로 구성된 마이크로 단편화 된 지방 조직의 생산을 초래합니다. 동결 고정 마이크로 단편화 된 지방 조직에 내장 된 젤라틴의 면역 불발 분석은 내피 세포 마커 울렉스 Europaeueus Agglutinin 1 수용체에 의해 표시된 혈관 네트워크를 보여주고 주로 작은 모세 혈관과 같은 혈관으로 구성된 구조를 강조한다. 특히, 뉴런-신경교항원 2 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타를 발현하는 pericytes는 일반적으로 분포되어 내피 세포를 내피 세포에 내피세포로 내피한다.
CD31 양성 내피 및 CD45 양성 조혈 세포를 제외함으로써, CD146 양성 CD34 음성 백혈구 및 CD146 음성 및 CD34 양성 출현 세포의 존재는 MAT 내에서 식별될 수 있습니다. 미세 단편화된 지방 조직은 면역조직화학적 염색, 체외 배양 또는 분비 분석에 의해 추가로 처리되어 지방 조직 생물학에 대한 심층적인 통찰력을 얻을 수 있다.
이 기술은 마우스에서 이식되거나 장기 문화에서 유지 될 정도로 작은 오르가노이드의 일종으로 자연, 네이티브, 입체 배열에 있는 다양한 조직의 연구를 허용합니다. 그리고 우리는 주로 이 시스템을 사용하여 다른 장기별 마이크로 환경에 실험적으로 접근합니다. 우리의 지방 조직 기증자는 전염성 감염의 운반대로 알려져 있지 않습니다.
그러나 추가 검열이 없는 경우에, 모든 인간 적인 조직은 잠재적으로 오염되고 그에 따라 취급되는 것으로 간주되어야 합니다.
