이 방법은 환자 유래 오가노이드가이 다중 스펙트럼 질환의 유전 적 및 표현형 이질성을 자주 모방하기 때문에 비뇨기과 암을 연구하는 신속하고 강력한 도구를 제공하기 때문에 중요합니다. 오가노이드는 제한된 양의 환자 생검 물질로부터 분리될 수 있고 하류 분석을 위해 신속하게 확장될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 오가노이드는 비뇨기과 암의 세포 및 분자 기초를 이해하는 데 도움이되는 모델과 암이 반응 할 수있는 치료법과 개별 환자를 예측할 수있는 정밀 의학 도구로 사용될 수 있습니다.
시작하려면 수술에서 신선한 거시경 생존 가능한 종양 표본을 수집하고 시료가 운송 중에 멸균 된 50 밀리리터 원뿔형 튜브 또는 소변 표본 항아리의 수송 매체에 잠겨 있는지 확인하십시오. 조직 무게, 샘플 설명 및 환자 표본 처리 시트의 혈액 및 소변 샘플에 관한 세부 정보를 포함한 표본 세부 정보를 기록하십시오. 조심스럽게 수송 배지를 10 밀리리터의 기본 배지로 교체하고 종양 조직이 중력에 의해 침전되도록하십시오.
다음으로, 포셉을 사용하여 종양 조직을 제거하고 멸균 된 90 밀리미터 페트리 접시에 넣으십시오. 조직의 무게를 임상 표본 처리 시트 및 해부 격자에 그램 또는 밀리그램으로 기록하십시오. 그런 다음 메스 핸들에 장착 된 일회용 메스 블레이드에 멸균 포셉을 사용하여 비 암 조직과 거시적으로 보이는 괴사 부위를 제거하십시오.
차가운 DPBS로 종양 조각을 한두 번 씻은 다음 수집하여 새로운 멸균 90mm 페트리 접시로 옮깁니다. 사진을 찍고, 조직도를 그리고, 임상 처리 그리드에서 조직 해부를 계획하십시오. 조직병리학적 분석을 위해, 종양 조직의 약 50 밀리그램을 라벨이 붙은 일회용 플라스틱 조직학 카세트에 넣는다.
그런 다음 조직학 카세트를 10% 중성 완충 포르말린의 5X 내지 10X 부피의 용기에 담그고 밤새 인큐베이션한다. 다음날 포르말린을 70 % 에탄올로 교체하여 조직이 처리 될 때까지 섭씨 네 도에서 보관하십시오. 분자 분석을 위해, 액체 질소를 사용하여 RNase, DNase 프리 1.5 밀리리터 냉동 온도에서 적어도 하나의 종양 조각을 스냅 동결시키고 영하 80 °C에서 저장하십시오.
다음으로, 나머지 종양 조각이 들어있는 90 밀리미터 페트리 접시에 다섯 밀리리터의 오가노이드 배지를 분배하고 가능한 한 미세하게 조직을 기계적으로 다듬는다. 멸균 번호 10 메스 블레이드를 사용합니다. 잘게 다진 조직을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 응집을 피하기 위해 4 밀리리터의 오가노이드 배지, 10X 콜라게나제 / 히알루로니다아제 1 밀리리터 및 밀리리터 DNase I 당 0.1 밀리그램을 첨가하십시오.
다진 종양 조직을 효소 용액에서 한두 시간 동안 인큐베이터의 오비탈 진탕기 또는 회전기 상에서 인큐베이션하여 단편을 세포 현탁액으로 해리시키고 콜라겐을 분해한다. 그런 다음 기본 배지의 두 배 부피를 샘플에 추가하여 소화를 중단하십시오. 샘플을 원심분리하고, 흡인하고, 상청액을 버린다.
다음으로, 오염된 적혈구를 용해시키기 위해, 펠렛을 오밀리리터의 염화암모늄칼륨 완충액에 재현탁시키고, 실온에서 삼분 동안 또는 적혈구의 완전한 용해가 보일 때까지 튜브를 인큐베이션한다. 그런 다음 튜브에 20 밀리리터의 기본 배지를 넣으십시오. 다시 원심분리하고 상청액을 흡인한다.
이 단계에서 2X 및 1X 오가노이드 배지의 10 밀리리터 분취량을 섭씨 37도 수조에 넣어 따뜻하게하십시오. 샘플을 먼저 미리 습윤된 가역 100미크론 스트레이너를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 여과하여 큰 불용성 물질을 제거합니다. 그런 다음 미리 습윤된 가역적 37 미크론 스트레이너를 통해 용출액을 여과하여 단일 세포 및 면역 세포 분리를 위해 작은 클러스터에서 단일 세포를 수집합니다.
그런 다음 37 미크론 스트레이너를 뒤집고 10 밀리리터의 기본 배지를 추가하여 작고 중간 크기의 클러스터를 수집하십시오. DPBS로 이 새로운 50밀리리터 튜브를 각각 40밀리리터까지 충전한 다음, 현탁액을 원심분리하고 상청액을 버립니다. 다음으로, 단일 세포가 들어있는 튜브에 10 밀리리터의 기본 배지를 추가하고 자동화 된 세포 카운터에서 트리판 블루 배제 염료를 사용하여 세포를 계산하십시오.
세포의 세포 수와 생존력을 결정하십시오. 나머지 샘플을 원심분리하고 배지를 10% 태아 소 혈청 1%페니실린과 스트렙토마이신 및 10%DMSO를 함유하는 세포 동결 용액 또는 기저 배지로 교체한 다음, 샘플을 1.5밀리리터 냉동 용기에 넣고 자체 냉동 용기에 보관한 다음 즉시 용기를 영하 80도 냉동고로 옮깁니다. 다음 날, 극저온을 극저온 액체 또는 공기 상 저장소로 옮겨 장기간 보관하십시오.
다음으로, 수집된 소형 및 중간 크기의 클러스터를 500 마이크로리터의 미리 예열된 2X 오가노이드 배지로 재현탁시킨다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 P-1000 멸균 필터 피펫 팁으로 BME를 세포에 넣고 부드럽게 섞으십시오. 재구성된 BME 혼합물 100 마이크로리터를 초저 부착, 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 웰에 신속하고 조심스럽게 피펫하고, 플레이트를 20 내지 30분 동안 인큐베이터에 위치시켜 응고시킨다.
인큐베이션 후 경험적으로 평가된 부피에 따라 하나 내지 두 개의 비율로 BME 세포 현탁액의 상부에 오가노이드 배지를 첨가하고, 플레이트를 20분 동안 인큐베이터에 배치하여 평형화시킨다. 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 현미경 스테이지의 시편 홀더에 조립하여 위상 대비 또는 밝은 필드 설정에서 오가노이드를 시각적으로 평가합니다. 고갈 된 성장 인자와 전체 부피를 보충하기 위해 미리 예열 된 오가노이드 배지 50 마이크로 리터를 사용하여 이틀에서 삼일마다 배지를 보충하십시오.
통과 전에 1, 2, 3, 5, 7 및 10일에 타임랩스 시리즈 이미지를 가져옵니다. 시판되는 콜라게나제/히알루로니다아제 및 DNase를 사용한 방광암 조직의 2시간 소화는 라미나 프로프리아제 내의 신생물성 세포와 방광의 근육층을 포함한 보다 복잡한 방광절제술 생검 조직의 0.5~1입방밀리미터 조각의 충분한 소화를 유도한다. 더 큰 소화 후 단편은 신규한 이차원 배양물을 단리하기 위해 임의의 크기의 배양 및 표준 조직 배양 플레이트에 적합하다.
이 절차에 의해 생성 된 오가노이드는 응집, 압축 및 단단한 세포 구조의 최종 형성을 포함하여 동적 자기 조립을 겪습니다. 조직학적으로, 이러한 구조는 원래의 환자 종양을 회수합니다. 이 절차에서 생성 된 오가노이드는 추가 조직 병리학 적 특성화, 바이오 뱅킹 및 약물 효능 테스트를 포함한 많은 목적에 적합합니다.
오가노이드의 생성 후, 항암 요법, 대사 프로파일링 또는 전사 프로파일링의 역할을 포함하여 이들 종양을 프로파일링하기 위해 추가적인 방법이 사용될 수 있다. 이 3D 프레임 워크 내에서 이러한 추가 방법론은 방광암 생물학에 대한 강력한 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 면역 종양학 및 세포 신진 대사를 조사하는 연구의 중요한 토대였습니다.
