이 방법은 세포 구조와 기능이 세포 수의 변화에 반응하는 방법과 같은 질문을 해결하기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형의 융합을 통해 혼란을 수 있습니다. 융합된 세포 내의 형광태그 단백질을 이미징함으로써 세포 구조는 세포 간장성 및 기능의 메커니즘을 연구하기 위해 그들의 세포 유형의 기원에 다시 언급될 수 있습니다. 형광염 염료 라벨링의 경우, 각 배양이 다음 날 아침까지 70~90%의 인플루언서에서 6세포로 적어도 6배10으로 확대될 정도로 관심있는 인간 암세포 집단을 참조한다.
라벨링 당일, 충청식 eGFP와 루트레틴-mScarlet 세포를 세척당 PBS 10밀리리터로 두 번 세척합니다. PBS및 파레드 셀 염료에서 500 나노몰러로 바이올렛 세포 염료를 PBS에서 200 나노몰러로 희석시. 뿌리 줄기 eGFP 세포를 희석된 바이올렛 세포 염료와 루트레틴-mScarlet 세포에 실온에서 1분 동안 희석된 파 레드 셀 염료로 라벨을 붙입니다.
인큐베이션이 끝나면 5분 동안 DMEM의 10밀리리터로 반응을 중지합니다. 라벨이 부착된 세포 배양과 10밀리리터의 신선한 PBS를 세척한 후 예동 트립신1밀리리터로 모든 배양을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 분리된 세포 용액을 개별 15 밀리리터 원심분리튜브로 옮기고 PBS의 1밀리리터와 DMEM의 1밀리리터로 표지되지 않은 세포로 염료 표지펠릿을 부드럽게 재연한다.
그런 다음 모든 세포 샘플을 세포 배양 인큐베이터로 반환합니다. 세포 융합 실험을 위해, 새로운 15 밀리리터 튜브에 파 레드 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터와 바이올렛 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터를 혼합하고 원심분리에 의해 나머지 혼합되지 않은 표시 되지 않은 세포를 퇴적. 신선한 DMEM의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
원심분리에 의해 혼합 된 세포를 수집하고 30 초 동안 펠릿에 드롭 현명한 방식으로 50%1450 PEG의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 3.5분 후, 30초 동안 10밀리리터의 세럼 없는 DMEM 드롭와이즈를 추가하고 튜브를 인큐베이터에 10분 간 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 혼합 세포를 침전시키고 완전한 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 재분리한다.
FACS에 의해 융합된 세포 인구를 위해 모든 세포를 70 마이크로미터 여과기를 통해 개별 FACS 튜브로 부드럽게 필터링하고 사이토미터 소프트웨어의 측면 분산 및 이중 차별 플롯에 대한 전방 산란을 만듭니다. 레이블이 없는 세포를 실행하여 형광 강도를 기록하고 융합된 세포를 식별하기 위해 게이트를 만듭니다. 다음으로, 단일 양성 바이올렛 염료 표지 세포를 실행하여 보라색 신호가 파 레드 채널로 유출되지 않고 단일 양성 극적 염료 표시 세포에 유출되지 않는지 확인하여 바이올렛 채널에 극적 신호가 없음을 확인한다.
그런 다음 융합 샘플을 짧게 실행하여 융합된 세포가 이러한 게이트와 함께 보이는지 확인합니다. 선별 매개 변수가 설정되면 선별 스트림을 100 마이크로리터의 성장 배지를 포함하는 8웰 이미징 접시에 중앙집중식으로 정렬하고 이중 양성 융합 세포를 접시에 직접 정렬합니다. 모든 세포가 정렬되면 즉시 2 ~ 16 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
면역형 염색의 경우, 먼저 실온에서 15분 동안 4%파라포름알데히드의 200마이크로리터로 세포 배양 상류체를 대체한다. 고정의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 0.1 %의 nonionic 계면 활성제의 200 마이크로 리터에서 세포를 투과화하기 전에 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척한다. 다음으로, 실온에서 30분 동안 PBS에서 3%소 세럼 알부민의 200마이크로리터를 적재하고, 150마이크로리터에 대한 관심 있는 항체로 라벨을 부착하여 염색 버퍼의 150마이크로리터로 비특이적 결합을 차단한다.
실온에서 1 시간 후, 세척 당 5 분 동안 PBS의 300 마이크로 리터에 세포를 두 번 세척. 마지막 세척 후, 신선한 PBS의 200 마이크로 리터로 세척을 교체하십시오. 융합된 세포의 심상을 취득하려면 4색 이미징이 가능한 적절한 형광 현미경을 사용하고 3차원 이미지를 수집합니다.
적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 높은 수준에서 형광 신호에 의해 유동 세포 측정 중에 볼 수 있습니다. 게이트는 이중 양성 세포 집단을 더 현미경 분석을 위해 이미징 접시에 직접 풍부하게 분류하도록 설정할 수 있습니다. 융합은 두 세포의 혼합을 통해 세포 아키텍처의 주요 재배열을 유도한다.
이종은 혈장 막을 개입하지 않고 단일 세포 내부에 혼합된 두 형광 염료 신호를 포함하는 세포로 확인된다. 추가적으로, 2개의 핵은 또한 브라이트필드 화상 진찰에 의해 융합된 세포에서 보일 수 있습니다. 세포 구조 및 기능은 meGFP 및 mScarlet 태그 단백질을 포함하는 세포의 병합을 통해 더 조사될 수 있다.
융합은 백중구 백센토리올 성분 NEDD1이 형광으로 태그될 때 적어도 4개의 pericentriolar 물질 로 보이는 이종 내부의 중척추 수의 두 배로 증가시다. 내인성 형광표 뿌리제와 세포의 융합은 각 중구의 기원의 세포가 이종에서 확인될 수 있게 한다. 이 프로토콜은 차별화된 라벨이 부착된 세포주를 융합하는 방법과 세포기관을 이미지하여 구조와 기능을 이해하는 방법을 보여줍니다.
이 강력한 프로토콜은 유사한 방법에 비해 비교적 쉽고 상대적으로 저렴합니다. 이 기술은 세포세포 융합이 어떻게 규제되는지, 세포가 세포 세포 외 세포 수의 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 다양한 질문을 하는 데 사용할 수 있습니다.
