이 프로토콜은 환자 자신의 혈소판이 풍부한 혈장과 5분 동안 표준화된 제제를 사용하여 인간 섬유아세포 배양을 위한 자가 시스템입니다. PRP는 배양에서 섬유아세포의 대규모 세포 확장을 촉진합니다. 자가 세포 치료를 위해 대규모 개울과 안전한 세포 확장이 필요할 때 PRP를 세포 보충제로 사용하여 이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜을 시도할 때 PRP 무결성을 확인하는 것이 좋습니다. 혈장은 적혈구가 없는 상태에서 매우 깨끗해야 합니다. 전송할 때 매우 신중하게 수행해야 합니다.
그리고 조직의 소화와 관련하여 진행하기 전에 매우 깨끗해야 합니다. 시작하려면 혈액이 채워진 혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 튜브를 조심스럽게 세 번 뒤집어 혈액과 항응고제를 혼합합니다. 고정된 45도 각도의 로터에서 1500g에서 5분 동안 혈액 샘플을 원심분리하고 튜브의 균형을 맞춥니다.
원심분리 후, 분획된 혈액은 분리 겔 아래에 갇힌 적혈구와 백혈구를 가지며 겔 표면의 혈소판을 갖는다. PRP 튜브를 부드럽게 20회 뒤집어 혈장 상등액에 혈소판 침착을 재현탁시킵니다. 혈소판이 젤에서 완전히 분리되고 혈장이 투명하고 투명하게 변해야합니다.
10 밀리리터 주사기에 연결된 이송 장치를 사용하여 튜브에서 플라즈마 용액을 수집하십시오. PBS가 있는 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 피부 샘플을 넣고 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 피부 샘플이 비교적 큰 경우 표피면이 아래로 향하도록 150제곱센티미터 조직 배양 접시의 뚜껑에 놓습니다.
집게와 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하십시오. 조직이 마르지 않도록 PBS에서 몇 분마다 조직을 헹굽니다. 지방 제거가 완료되면 메스를 사용하여 피부 샘플을 약 0.5 x 1.5 센티미터의 스트립으로 자릅니다.
다음으로, 5 밀리리터의 콜라게나제 / 디스 파아제 혼합물을 멸균 된 15 밀리리터 튜브에 첨가한다. 절단된 조직을 튜브에 옮깁니다. 티슈 조각이 용액에 잠겨 있는지 확인하고 튜브를 단단히 덮습니다.
튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 150분 동안 궤도를 흔들어 놓습니다. 배양 후 조직이 들어 있는 튜브를 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 멸균된 100mm 배양 접시의 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 놓습니다.
조직 현탁액을 튀지 않고 100mm 배양 접시의 바닥으로 옮깁니다. 튜브에 조직 조각이 남아 있으면 멸균 1 밀리리터 피펫 또는 멸균 집게를 사용하여 조각을 배양 접시 바닥으로 옮깁니다. 표피가 위를 향하도록 하여 한 쌍의 집게로 진피를 잡습니다.
다른 한 쌍의 집게로 표피의 가장자리를 잡고 진피와 표피를 떼어냅니다. 분리된 조각을 동일한 뚜껑에 보관하고 PBS가 들어 있는 새로운 100mm 배양 접시에 진피 조각을 넣습니다. 다음으로, 실험실 겸자를 사용하여 3밀리리터의 0.3% 트립신 PBS가 들어 있는 15밀리리터의 폴리프로필렌 튜브에 진피 조각을 옮깁니다.
섭씨 37도의 수조에서 튜브를 배양하고 튜브를 여러 번 뒤집어 2-3분마다 내용물을 혼합합니다. 10 내지 20분 후, 3 내지 5밀리리터의 얼음-차가운 완전 성장 배지를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 튜브를 여러 번 격렬하게 소용돌이칩니다.
섬유아세포가 포함된 현탁액을 85미크론 나일론 메쉬를 통해 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 섬유아세포 용액 150g에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 세포 계수를 위해 100 내지 200 마이크로리터의 완전한 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
세포를 25제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 플레이트합니다. 그런 다음 플라스크를 섭씨 37도에서 배양합니다. 부착되지 않은 세포가 포함된 배지는 다음 날에, 그리고 다시 3-4일마다 교체하십시오.
섬유아세포가 70 80% confluency를 도달할 때, PBS로 그(것)들을 세척하고 Trypsin-EDTA 해결책을 추가하십시오. 플라스크를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양한 후, 3 내지 5밀리리터의 따뜻한 완전 성장 배지를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 200g에서 5분 동안 원심분리한다.
흡인에 의해 상청액을 제거합니다. PRP 배지에서 섬유아세포를 배양하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 권장되는 최소 세포 밀도는 제곱 센티미터 당 4, 000 생존 세포입니다.
전용 의료 기기를 사용하여 10 명의 다른 환자의 전혈을 처리하여 PRP를 생산했습니다. 이 장치는 대부분의 적혈구와 백혈구를 제거했습니다. PRP의 평균 혈소판 농도는 전혈의 혈소판 농도보다 약 50% 높았습니다.
자가 섬유아세포는 10% FBS를 갖는 배지 또는 1 내지 50% 범위의 PRP 농도를 갖는 배지에서 배양하였으며, 배양 7일 후, 배지를 바꾸지 않고, 20% PRP로 프라이밍된 배양은 더 많은 수의 생존 가능한 섬유아세포를 나타냈다. PRP는 FBS에 비해 최대 7.7배까지 증식 촉진제로서 강력한 효과를 보였습니다. 팔로이딘 염색은 PRP 활성화 시 관찰되는 형태학적 변화가 섬유아세포 활성화의 시그니처인 F-액틴 재구성과 관련이 있음을 보여주었습니다.
급속한 세포 확장의 주요 관심사는 게놈 변형의 위험입니다. 이를 평가하기 위해 비교 게놈 혼성화 분석을 수행하여 세포의 게놈 안정성을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 FBS를 PRP로 대체하는 것입니다., 더 강력한 자가 생물학적 보충제입니다.
이를 통해 연구원은 이종 물질을 추가하지 않고도 더 많은 세포를 더 빠르게 성장시킬 수 있습니다. 임상 적용 전에 생체 외 확장이 필요한 다른 세포 유형(예: 각질세포 또는 중간엽 줄기 세포)에 이 기술을 사용할 수 있습니다.
