이 프로토콜은 표적 유전자 전달이 B-1a 세포 국소화 및 기능에 어떻게 영향을 미치는지 평가할 수 있고 생체 내의 유전자 치료 잠재력을 검토하기위한 개념 접근법의 유용한 증거가 될 수 있습니다. 이 방법은 1차 B-1a 세포에 안정적이고 비교적 효율적인 유전자 전달을 제공하고 기증자 세포 표현형 및 기능 사후 입양 전달의 식별을 허용한다. 이 방법은 세포 생존, 증식 및 기능을 포함하는 생체 내의 다양한 기증자 및 숙주 세포 프로세스를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 다른 입양 전달 시스템에 적용될 수 있다.
수막 유체 수확은 까다로울 수 있습니다. 회복을 극대화하고 하원 세포 인구를 오염시킬 수 있는 장에 구멍을 뚫지 않도록 세포를 철저히 분리하십시오. 복막 B-1 세포 수집의 경우 직선 수술 가위를 사용하여 12 주에서 14 주 된 남성, CD45.1 + 아폴리포폴단백질 E 녹아웃 마우스의 복부에 피상적 인 컷을 만들고 곡선 가위를 사용하여 피부를 벗겨 내어 복막 벽을 노출시하십시오.
25 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 복막 구멍을 37도 RPMI-1640 배지의 10 밀리리터로 플러시합니다. 그리고 마우스가 15~20초 동안 좌우로 완전히 흔들릴 수 있도록 꼬리의 베이스를 잡습니다. 흔들린 후 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 고관절 의 오른쪽 아래에서 액체를 흡인하고 창자 근처의 장 근처에서 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 주사기지방 창고와 기본 장기를 방해하지 않도록 주의하십시오.
6~7밀리리터의 라베이지를 수집한 후 얼음 위에 50밀리리터 원추형 튜브에 액체를 분배합니다. 집게를 사용하여 다이어프램 위의 복막 벽을 파악하여 동물의 수직 고도를 허용하여 나머지 유체가 복막 구멍의 바닥에 남아 있게 합니다. 간 자체를 절단하지 않고 간 위의 회막 벽에 작은 절단을 만들기 위해 외과 가위를 사용합니다.
그리고 유리 파이프와 전구를 사용하여 남은 수막 유체를 수집합니다. 모든 유체가 수집되면, 모든 마우스로부터 복막 세척 세포를 알리쿼트와 얼음에 50 밀리리터 튜브에서 튜브 농도당 8번째 세포에 최대 10배까지 첨가한다. 그리고 원심분리에 의한 세포를 퇴적시한다.
각 펠릿을 항 CD16/CD32 항체의 1밀리리터로 재보설하여 4°C에서 10분 동안 분석 버퍼에서 1-50 비율로 희석하였다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 20분 배양에 생체개화 항체 마스터 믹스의 동일한 볼륨을 추가하고 튜브 당 분석 버퍼의 5 밀리리터에 세척한다. 항 비오틴 마이크로비드의 적절한 부피와 적절한 인큐베이션 지속 시간으로 펠릿을 다시 중단하고 세포 농도 및 제조업체의 권고에 따라 튜브 당 5 밀리리터 분석 버퍼 워시를 한다.
각 펠릿을 500 마이크로리터의 분석 버퍼로 재보선하고 컬럼당 3밀리리터의 분석 버퍼가 있는 적절한 자기 선택 컬럼수를 누를 수 있습니다. 얼음 위에 15 밀리리터 원추형 튜브에서 농축 된 B-1 세포를 포함하는 용출을 수집하는 프라이밍 컬럼에 세포를 전달합니다. 그런 다음 전체 수집 된 부피가 10 밀리리터가 될 때까지 추가 분석 버퍼로 각 자기 선택 컬럼을 세척하고 B 세포 배양 배지에서 밀리리터 농도당 10 내지 여섯 번째 세포로 10 시에 정수 된 세포 분획을 재연한다.
회중 B-1 세포를 비유도 제어를 위해 7번째 세포에 10번 이상 따로 설정하고 나머지 세포를 트랜스포팅을 위한 두 개의 동등한 부피로 분할한다. 중간 농도의 150 마이크로 리터 당 다섯 번째 세포에 1.5 배 10으로 세포를 희석하고 트랜스듀션 상태를 위해 96 웰의 우물에 세포의 150 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 TLR9 작용제 100나노몰러를 각 우물에 넣고 16~18시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치한다.
복막 B 세포의 레트로바이러스 트랜스듀션을 위해 얼음에 칼슘 인산염 트랜스페이션 레트로바이러스 입자 를 해동하고 즉시 폴리브레인및 신선한 베타 메랑골의 밀리리터 당 8 마이크로그램의 존재에 20 대 1의 적절한 플레이트 및 복합 감염의 각 우물에 제어 및 케모킨 수용체 레트로 바이러스 과민제를 추가합니다. 모든 바이러스가 추가되면, 원심분리에 의해 세포를 소독하고 3시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 판을 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 B 세포 배지와 하룻밤 배양에 replating세포를 수확.
다른 하막 세포 유형의 자기 고갈 후, 후 고갈 분획에 있는 살아있는 단일 세포는 F4/80+대식세포에 비해 CD19+B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5hi CD19-T 세포의 부족은, 그리고 그(것)들은 CD19+CD5 배지 B-1a 세포의 증가한 주파수를 포함하고 있습니다 전 고갈 분획에 비교된. 그리고 성공적으로 전염된 GFP+B-2, B-1, B-1a 및 B-1b 세포 서브셋의 빈도증가는 감염의 바이러스 복합성 증가와 직접적으로 상관된다. 그리고 24웰 또는 6웰 플레이트의 사용에 비해 96개의 잘 둥근 바닥 플레이트를 사용하여 트랜스듀션 효율을 더욱 높일 수 있다.
CXCR4-GFP 레트로바이러스 트랜스듀션은 B 세포 생존가능성에 큰 영향을 미치지 않으면서 성공적인 B-1 세포 CXCR4 과발현및 CXCL12로의 체외 이동증가를 유도할 수 있다. 또한, 채택적으로 전송된 CD45.1+기증자 세포는 CD45.2 수신자 마우스의 골수 및 비장에서 회복한 후 CXCR4 과발현을 17주 후 세포 전달하였다. 참고, CXCR4 발현과 골수에 대한 기증자 세포 국소화 사이의 양성 연관성이 결정되었지만 비장은 결정되었다.
골수의 기증자 세포 수와 항 MDA-저밀도 지단백 IgM의 혈장 양 사이에서 관찰된 긍정적인 연관성. 많은 추가 기술은 질병 발달에 표적으로 한 유전자 전달의 충격 또는 기증자가 호스트 생리학에 영향을 미치는 분비한 요인을 파생하는 것과 같은 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다.
