우리의 프로토콜을 통해 가정 서식지에서 직접 미생물 화학 요법을 강력하게 정량화할 수 있습니다. 따라서 미생물을 분리할 수 있으며 신진 대사 잠재력을 더 잘 정량화하고 이해할 수 있습니다. 즉, 시투 화학 요법 분석또는 ISCA는 미생물 행동에 대한 새로운 통찰력을 허용하므로 액체 위상이있는 환경에서 미생물의 역할과 기능을 허용하는 유연하고 사용자 친화적이며 간단한 장치입니다.
실험실과 현장에서 배포 절차를 시연하는 것은 현재 내 연구 그룹에서 박사 과정 학생인 에스텔 클레르크입니다. 화학 요법을 준비하기 전에 0.2 마이크로미터 필터로 매체를 필터링하고 필터링 된 용액을 자동 복제합니다. 다음으로, 멸균 배지의 1 밀리리터에서 화학 요법의 10 밀리머용액을 준비하고, 0.2 마이크로미터 주사기 필터로 화학 요법용액을 걸러 입자와 잠재적인 오염물질을 제거한다.
그런 다음, 실험 프로토콜에 따라 여과된 화학섬유 스톡 솔루션을 연렬히 희석시켰다. ISCA를 채우기 위해 27 게이지 바늘을 1 밀리리터 주사기에 부착하고 여과된 화학 요법제의 각 농도에 대해 하나의 주사기를 적재합니다. 포트가 위쪽으로 향하는 장치를 잡고, 각 포트 위에 작은 물방울이 나타날 때까지 장치의 5개의 우물 각각에 물질의 각 농도를 천천히 주입합니다.
모든 우물이 채워지면, 적절한 세균 배양 배지의 150 밀리리터에 대한 관심의 해양 또는 담수 박테리아 배양의 1.5 밀리리터를 전송한다. 다음으로, 200 밀리리터 용량 트레이의 평평한 표면에 양면 접착제 테이프 두 조각을 놓습니다. 그리고 테이프의 각 조각에 하나의 ISCA를 확보.
50 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 배치 트레이를 세균용 용액으로 천천히 채웁니다. 그리고 박테리아가 1 시간 동안 관심의 화학 요법에 반응 할 수 있습니다. 분석을 종료하려면 새로운 50 밀리리터 파이펫을 사용하여 ISCA 트레이에서 매체를 부드럽게 제거합니다.
샘플을 검색하려면 먼저 ISCA를 배치하여 포트가 아래쪽으로 향하도록 합니다. 다음으로, 27 게이지 바늘이 장착된 멸균 1 밀리리터 주사기를 사용하여 각 우물에서 용액을 끌어들이는다. 동일한 농도의 각 행에서 샘플을 단일 튜브로 끌어당깁니다.
이어서, 각 화학요법 농도에 끌리는 박테리아의 수를 결정하기 위해 혈중 세포측정에 의해 샘플을 분석한다. 현장 배치를 위해 ISCA를 준비하려면 먼저 현장 측에서 ISCA 당 5 밀리리터의 물을 수집하고 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 통해 물을 50 밀리리터 원유형 튜브로 필터링합니다. 각 헹구기 후 새로운 50 밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에서 여과물을 수집하여 수성 GP 필터 카트리지를 두 번 통과합니다.
그런 다음 0.02 마이크로미터 주사기 필터를 통해 물을 새로운 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 개별 15 밀리리터 원추형 튜브에서 원하는 농도에 관심있는 모든 화학 요법을 재보중단하기 위해 여과의 알리쿼트를 사용합니다. 그런 다음 10 밀리리터 주사기를 사용하여 개별 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 통해 재중단된 화학 물질을 멸균 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 필터링하여 원치 않는 입자 또는 물 불용성 화합물을 제거합니다.
ISCA 필드 배포의 경우 각 ISCA를 장치 인클로저의 9피스에 나사로 배치하고 인클로저를 닫습니다. 접착제 테이프로 인클로저를 밀봉하고 번지 코드를 사용하여 인클로저를 배치 팔과 인간이 만든 구조로 고정합니다. 또는, 인클로저는 얕은 기판에 작은 무게로 고정되거나 펠라기 의 바다에서 그물에 부착 될 수있다.
인클로저를 완전히 잠그고 충전을 시작하여 인클로저를 단단히 잡고 내부의 과도한 물 이동을 방지합니다. 물의 수위가 인클로저 의 상단에 도달하면 내부에 공기가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 인클로저가 완전히 가득 차면 두 개의 플러그로 바닥과 상단 구멍을 밀봉합니다.
그런 다음 ISCA를 1~3시간 동안 제자리에 둡니다. 샘플링 기간이 끝나면 물에서 인클로저를 제거합니다. 인클로저를 용기 위에 놓고 물을 배출하고 앞 구멍에서 접착제 테이프의 상부를 조심스럽게 제거합니다.
수선이 ISCA 의 상단 아래로 지나면 하단 플러그를 제거하고 나머지 물을 배출하십시오. ISCA는 여전히 인클로저에 부착되어 있지만, 1 밀리리터 파이펫 또는 1 밀리리터 주사기를 사용하여 각 ISCA 위에 갇힌 물을 조심스럽게 제거하고 상부 표면을 건드리지 않고 ISCA를 제거하십시오. 그런 다음 일회용 와이프를 사용하여 표면에 남아있는 액체를 제거하고 실험실 샘플 검색에 대해 설명한 대로 샘플을 회수합니다.
이러한 대표적인 체외 분석에서, 1 밀리몰러는 여과된 해수 대조군보다 18배 높은 유의한 화학 반응을 유도함에 따라 최적의 글루타민 배치 농도로 판단되었다. 글루타민의 높고 낮은 농도는 또한 중요 한 유도, 하지만 약한, 화학 반응. 이 현장 배치 분석에서, 5 개의 ISCA 복제1 밀리몰러 글루타민으로 가득 차 1 시간 동안 배포 되었다 시드니 근처 해안 사이트에 1 시간 동안 배포, 호주.
그리고 ISCA가 채워진 글루타민은 여과된 바닷물로 채워진 대조군 우물보다 거의 3배 더 많은 박테리아를 끌어들였습니다. 실험실과 현장에서 ISCA를 배포할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 화학 요법을 방지하는 강력한 유체 흐름을 생성하지 않는 것입니다. ISCA 유래 견본은 특정 유기체 또는 유전자를 확인하기 위하여 이용될 수 있고, 화학 유기체의 유전체 잠재력을 특성화하고, 선택적인 매체에 특정 긴장의 표적한 격리를 위해 이용될 수 있습니다.
