라이브 셀 Bdellovibrio bacteriovorus 화상 진찰은 이 약탈한 박테리아의 복잡한 생활 주기 때문에 도전적이되었습니다. 우리의 프로토콜은 실시간으로 완전한 수명 주기의 단계를 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 특정 균등균균에 근거하더라도, 병원성 긴장을 포함하여 세균성 긴장의 각종에 쉽게 적응될 수 있습니다.
B.bacteriovorus 문화를 설정하려면, 신선한 24 시간 배양 박테리아의 1 밀리리터와 하룻밤 먹이 문화의 세 밀리리터를 결합 250 밀리리터 칼슘 히피 버퍼의 50 필요에 따라 항생제로 보충. 섭씨 30도에서 24시간 배양하고 분당 200개의 회전을 한 후, 먹이 세포가 액체 장착 얼굴 대비 현미경 검사법에 의해 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 수많은 다중 공격 단계B.bacteriovorus 세포가 존재해야 하며 E.coli 세포 또는 bdelloplast를 볼 수 없어야 합니다.
B.bacteriovorus 배양을 0.45 마이크로미터 모공 크기 필터를 50 밀리리터 원내 튜브로 변형시키고 원심분리기의 여과를 중단합니다. 그런 다음 B.bacteriovorus 펠릿을 칼슘 히피 버퍼 의 3 밀리리터에서 약 0.2의 600 나노미터에서 최종 광학 밀도로 다시 중단하고 30 분당 30도 및 200 회전에서 박테리아를 배양합니다. 숙주 세포를 준비하려면 숙주 균주에서 단일 콜로니를 선택하고 10 밀리리터의 YT 배지에서 박테리아를 숙인하여 1박 잠식에 필요한 항생제로 보충하고 분당 180개의 회전을 한다.
다음 아침 은 2 밀리 리터 테스트 튜브와 원심 분리에 의해 세포를 펠릿하룻밤 문화의 두 밀리리터를 전송. 그런 다음 칼슘 히피 버퍼의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 먹이 세포가 단일 세포 수준에서 분리되어 있는지 확인하기 위해 원심 분리 후 전체 셀 펠릿을 완전히 다시 중단하는 것이 매우 중요합니다.
시간 경과 형광 현미경 검사법을 위해 세포를 준비하려면 먼저 200 밀리그램의 낮은 형광 분자 등급아가로즈를 20 밀리리터의 칼슘 히피 버퍼와 혼합하고 파수기로 녹입니다. 녹인 아가로즈 3밀리리터를 35mm 유리 바닥 접시에 붓고 아가로즈가 고화되도록 합니다. 실험실 마이크로 주걱을 사용하여 패드의 중앙 기둥을 방해하지 않고 접시에서 아가로즈 패드를 조심스럽게 제거하고 패드 바닥을 페트리 접시 덮개에 올려 놓습니다.
농축 된 숙주 세포 현탁액 5 개를 뒤집힌 패드에 놓고 접종 루프를 사용하여 중앙 극에 세포를 퍼뜨리게합니다. 다음으로 농축된 B.bacteriovorus 현탁액 5개에 퍼지지 않고 주전자 코팅 표면에 마이크로리터를 넣고 젤을 35밀리리터 유리 바닥 접시 상면으로 빠르게 되돌려 줍니다. 그런 다음 뚜껑으로 접시를 덮습니다.
공동 배양의 시간 경과 플로레시네이션 현미경 검사용은 접시를 실험 과정에서 움직이지 않도록 페트리 접시 홀더에 놓고 1방울의 침수 오일을 반전 된 현미경 목표에 놓고 접시 바닥에 한 방울을 놓습니다. 반전된 현미경 챔버 내의 현미경 단계에 홀더를 장착하고 현미경 소프트웨어에서 배율을 100X로 설정하고 GFP및 Mcherry에 다크롬 렌즈를 설정합니다. 브라이트필드에서 iPS를 사용하여 초점 평면을 찾아 무의미한 관리자를 엽니다.
스테이지를 이동하고 표시점 버튼을 사용하여 관심 있는 위치가 최소 10개 이상의 좌표를 저장합니다. iPS에서 모니터로 카메라 용을 전환합니다. 초점 평면을 설정하고 무의미한 교체 점 버튼을 클릭하여 관리자에게 각 점을 보정합니다.
실험 디자이너를 열고 질병 스태킹 상자를 표시 해제합니다. 적절한 형광 채널과 최적의 제거 설정을 선택하고 이미지 수집과 실험의 총 시간 사이의 간격을 설정합니다. 선택한 위치에 대한 포커스 유지 관리를 활성화하고 이미지 파일을 자동으로 저장해야 하는 데이터 폴더를 선택합니다.
현미경 소프트웨어 제어의 모든 설정을 다시 확인하고 시간 경과 실험을 시작합니다. 실험의 첫 번째 시간 후에도 모든 스테이지 위치가 여전히 집중되어 있는지 확인합니다. 시간 경과 실험이 완료되면 페트리 접시를 제거하고 적절한 생체 안전 프로토콜에 따라 아가로즈 패드로 35mm 접시를 폐기하십시오.
타임랩스 이미지 데이터의 처리를 위해 실험 데이터를 피지 소프트웨어가 탑재된 컴퓨터로 전송하고 피지에서 이미지를 엽니다. 바이오 포맷 가져오기 옵션에서 하이퍼스택이 있는 뷰 스택을 선택합니다. 복합 색상 모드에서는 자동 축척을 선택합니다.
이미지 스택을 스크롤하여 세포와 bdelloplasts가 실험 과정에서 포커스를 유지했는지 여부를 평가합니다. DNA와 mNeon 녹색에서 녹색 형광 반점이 성장 단계 전반에 걸쳐 bdelloplasts 안쪽에 B.bacteriovorus 세포 안에 존재하는지 그리고 약탈 수명 주기의 모든 단계가 시각화될 수 있는지 여부. 특정 B.bacteriovorus 세포 bdelloplast를 분석하려면 선택 도구를 사용하여 관심 있는 셀을 표시합니다.
그런 다음 선택한 영역을 복제합니다. 중복된 이미지에서 프로세스를 클릭하고 매끄럽고 각 형광 채널에 대해 이미지, 색상, 채널 도구를 클릭하고 관심 있는 채널을 선택합니다. 그런 다음 이미지, 조정 및 밝기 대비를 클릭하여 각 채널에서 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
축척 막대를 추가하려면 분석, 도구 및 배율 막대를 선택합니다. 이미지에 타임스탬프를 추가하려면 이미지, 스택 및 시간 스탬퍼를 클릭합니다. 수정된 이미지를 저장하려면 TIF를 선택합니다.
데이터를 이미지 시퀀스로 저장하려면 AVI가 현재 프레임의 단일 이미지를 저장하기 위해 동영상을 생성하거나 PNG를 생성합니다. 이 시간 경과 형광 현미경 기반 시스템은 개별 B.bacteriovorus 세포의 실시간 추적을 허용하고 복잡한 약탈 수명 주기의 각 단계에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 알약 mCherry 융합은 전체 약탈 세포가 성장 단계의 초기 단계에서뿐만 아니라 공격 단계뿐만 아니라 공격 단계에서 표시 될 수 있습니다.
공격에서 복제 단계로의 전환은 호스트 bdelloplast 형성뿐만 아니라 replisome의 모양으로 도포할 수 있습니다. 레플리솜은 침입 세포극에서 조립되며, 번식상이 진행됨에 따라 성장하는 B.bacteriovorus 필라멘트 내에서 하나 이상의 replisome를 관찰할 수 있다. 염색체의 여러 복사본이 합성되면 복제가 종료됩니다.
마지막으로, 다핵 필라멘트는 정화를 거치고 자손 세포는 bdelloplast에서 방출됩니다. B.bacteriovorus 세포는 적극적으로 그들의 먹이를 검색하기에 충분한 물질이어야하며 전체 세포 밀도는 약탈 세포 부착을 허용 할 만큼 충분히 높아야합니다. 이 플랫폼은 다중 약물 내성 병원균을 포함하는 실험에서 유용할 수 있으며 인간 및 수의학에서 살아있는 항생제로 B.bacteriovorus의 유전 공학의 개선을 용이하게할 수 있습니다.
