이러한 방법은 부분 최소 제곱 회귀를 사용하는 다변량 시스템 분석의 일환으로 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 부상에 대한 뇌의 반응에 대한 전체적인 시각을 더 많이 제공하는 데 사용됩니다. 손상을 유도하려면 마취 된 마우스에서 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인하고 마우스를 얇은 막의 중앙에있는 경향이있는 위치에 놓습니다.
양손을 사용하여 가르치는 조직을 잡고 마우스의 꼬리를 엄지 손가락 아래에 고정하고 가이드 튜브 아래에 마우스 머리를 놓습니다. 마우스가 제자리에 있을 때, 눈의 뒤쪽과 귀의 앞쪽 사이의 충격을 목표로 하여, 가이드 튜브의 상단에서 마우스 머리의 등쪽 측면에 볼트를 떨어뜨립니다. 충격이 가해지면 마우스가 조직을 뚫고 목에 대한 머리가 빠르게 가속됩니다.
부상 후, 마우스가 섭씨 37도 온난화 패드의 수핀 위치에서 회복되도록하십시오. 두 분간의 안정화 기간이 지난 후 DCS 센서를 마우스 두개골의 오른쪽 반구 위에 부드럽게 올려 놓으면 광학 센서의 위쪽 가장자리가 눈 뒤쪽과 정렬되고 센서 측면이 중간선을 따라 정렬됩니다. 센서에 손을 얹어 실내 조명으로부터 보호하고 다섯 초의 데이터를 수집합니다.
그런 다음 센서를 왼쪽 반구 위에 재배치하고 다섯 초의 왼쪽 반구 데이터를 수집합니다. 다중화된 사이토카인 및 포스포-단백질 생산을 평가하려면, 수확된 동물 뇌 조직의 약 3밀리그램당 150마이크로리터의 혼합 용해 완충액을 첨가한다. 1, 000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 조직을 15 내지 20회 기계적으로 트리트레이트한다.
균질화된 샘플을 섭씨 네 도에서 30분 동안 회전기 상에 놓고 원심분리에 의해 조직 파편을 수집한다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 샘플을 원심분리하여 남아있는 침전물을 제거하십시오. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 표준 프로토콜에 따라 BCA 분석법으로 단백질 농도를 결정합니다.
새로운 튜브에서 선형 범위 분석에 의해 결정된 최적의 단백질 농도로 각 샘플의 25 마이크로리터를 준비합니다. 분석 완충액을 사용하여 각 샘플의 총 부피를 25 마이크로리터로 정규화합니다. 분석 플레이트를 제조하기 위해, 200 마이크로리터의 세척 완충액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 분당 750 회전으로 10분 동안 진탕기 상에서 진탕한다.
인큐베이션이 끝나면 세척 버퍼를 데칸트하고 플레이트를 종이 타월 위에 두드려 잔류 물을 제거하십시오. 다음으로, 25 마이크로리터의 분석 완충액을 각 웰에 첨가한 다음, 배경 웰에 25 마이크로리터의 완충액을 추가로 첨가한다. 희석된 샘플 25 마이크로리터를 적절한 샘플 웰에 첨가하고, 다중화된 자기 비드를 통해 1분 동안 와류시킨 다음, 25 마이크로리터의 완전히 재현탁된 비드를 각 웰에 첨가한다.
모든 비드가 첨가되면 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 호일로 덮고 섭씨 두 ~ 여덟 도에서 흔들면서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음날 아침, 플레이트를 자기 분리기 위에 놓고 웰이 자석과 정렬되어 있는지 확인하십시오. 2분 후, 자기 분리기에 여전히 부착된 플레이트로 웰 내용물을 데칸트하고 각 웰에 200 마이크로리터의 세척 완충액을 첨가한다.
두 분 동안 흔들어 놓은 후 플레이트를 자기 분리기 위에 두 분 동안 놓습니다. 이어서, 자기 분리기에 여전히 부착된 플레이트로 웰 내용물을 데칸트하고, 방금 입증된 바와 같이 웰 당 200 마이크로리터의 신선한 세척 완충액으로 플레이트를 세척한다. 두 번째 세척 후, 웰 당 25 마이크로리터의 검출 항체를 첨가하고, 실온에서 분당 750 회전에서 한 시간 인큐베이션을 위해 호일로 다시 덮는다.
인큐베이션이 끝나면 25 마이크로리터의 스트렙타비딘 피코에리트린을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 추가로 30분 동안 진탕기로 복귀시킨다. 인큐베이션이 끝나면 플레이트를 두 분 동안 자기 분리기 위에 놓고 우물 내용물을 디캔팅하십시오. 세척 당 200 마이크로리터의 신선한 세척 완충액으로 플레이트를 두 번 세척하고 각 웰에 적절한 구동액 75 마이크로리터를 첨가한다.
그런 다음 실온에서 다섯 분 동안 플레이트 쉐이커에 비드를 다시 현탁하고 제조업체의 지침에 따라 분석기의 플레이트를 읽으십시오. 이 분석에서, 대뇌 혈류는 마지막 손상 후 네 시간 후에 확산 상관 분광법으로 측정되었다. 이어서, 각 반구에 대한 대뇌 혈류 지수 및 평균 대뇌 유동 지수가 결정될 수 있다.
선형 범위 분석은 모든 샘플에서 데이터를 수집하기 전에 적절한 단백질 로딩 질량을 결정하기 위해 수행 될 수 있습니다. 사이토카인 데이터는 샘플 데이터로부터 배경 측정치를 뺀 다음, 각 양극액에 대한 Z-스코어 데이터를 계산함으로써 제조될 수 있다. 부분적 최소 제곱 회귀는 식세포 미세아교세포 활성화 마커 또는 다른 관심 변수를 반응 변수로서 사용하고, 사이토카인 측정을 예측 변수로서 사용하여 수행될 수 있다.
Varimax 회전은 활성화 마커 측정과 함께 잠복 변수 하나에 대한 데이터의 공분산을 최대화하기 위해 수행 될 수 있습니다. 잠복 변수에서의 높은 로딩 가중치는 활성화 마커의 높은 발현과 가장 관련된 사이토카인 발현과 상응한다. 활성화 마커와 사이토카인 사이의 선형 회귀는 잠복 변수에서 가장 큰 로딩 가중치를 갖는 사이토카인이 또한 이 분석에 대해 통계적으로 유의하다는 것을 예시한다.
우리는이 프로토콜을 외상성 뇌 손상에 초점을 맞추었지만 이러한 방법은 뇌에 영향을 미치는 많은 병리학 적 상태에 대한 연구에 널리 일반화 될 수 있습니다. 우리는 이러한 기술을 사용하여 인과 관계 적 관계를 수립하고 궁극적으로 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 목표로 향후 실험에서 조절할 수있는 견인 가능한 표적을 식별하는 데 도움을줍니다.
