우리가 MDR이라고 부르는 간단하고 저렴한 방법은 pachytene 정자 세포, 둥근 정자 및 마우스 고환에서 정자를 길게 하는 농축 된 인구를 격리 할 수 있습니다. MDR 방법의 주요 장점은 단순성입니다. 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 사용할 수 있는 표준 실험실 장비만 필요합니다.
MDR 프로토콜은 남성 세균 세포에 기능적인 연구를 하는 연구원을 위해 중대합니다. 예를 들면, 정자 발생을 공부하고 있는 단, 남성 비옥에 영향을 미치는 요인, 뿐만 아니라 친자 후성 유전학 상속. MDR 메서드에는 최소한의 시작 재료가 필요합니다.
그리고 사실, 우리는 정기적으로 하나의 성인 남성 마우스를 사용하여 세포의 좋은 양을 얻을. 먼저 필요한 장비와 시약을 설정합니다. 수조를 섭씨 37도까지 설정하고 세포 배양은 섭씨 34도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 설정합니다.
인큐베이터 내부에 튜브 회전기를 배치합니다. 적당한 양의 현미경 유리 슬라이드를 준비하고 라벨을 붙인 다음 직경 약 1센티미터의 고리를 그리스 펜으로 그려 기름을 말리게 합니다. 동물을 해부 할 준비가되면 70 %의 에탄올로 마우스의 복부를 스프레이하고 가위를 사용하여 복부 골반 구멍에서 V 모양을 열어 두십시오.
집게로 부피성 지방 패드를 당기고 고환을 찾아 가위로 제거하여 튜니카 알부진을 방해하지 않도록하십시오. 1X KREBS가 들어있는 6센티미터 페트리 접시에 고환을 놓습니다. 고환을 분리하고 튜니카 알부진을 버린 다음, 포셉으로 부드럽게 놀리면 반열구를 약간 분산시합니다.
갓 준비된 콜라게나아제 용액 2밀리리터를 포함하는 50밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오. 37도의 수조에서 3분간 튜브를 배양하여 흔들어 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 따뜻한 1X KREBS의 적어도 40 밀리리터를 추가하고 튜블러가 실온에서 퇴적물을 할 수 있도록 합니다.
상체를 제거하고 다시 한 번 세척을 반복합니다. 갓 준비한 트립신 솔루션 25밀리리터를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터 내부에 회전기 위에 튜브를 놓고 15~20분 동안 튜브를 그대로 두고 약 15rpm에서 회전합니다.
산발적으로 튜블을 확인합니다. 용액이 흐리고 튜벌레의 작은 조각만 남아 있으면 튜브를 얼음 위에 놓고 다음 단계로 진행하십시오. 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 얼음 위에 새로운 50밀리리터 원피스 튜브로 솔루션을 필터링합니다.
그런 다음 세포를 펠릿하기 위해 섭씨 4도에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리합니다. 조심스럽게 상체를 부어 1X KREBS의 나머지 부분에 세포를 다시 중단 세포 펠릿을 누릅니다. 감기 1X KREBS의 적어도 40밀리리터를 재일시 중단된 세포에 추가하고 원심분리를 반복합니다.
튜브를 눌러 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 파이펫 팁을 1 밀리리터 파이펫에 장착하고 조리개가 직경이 약 3밀리미터되도록 잘라냅니다. KREBS에서 최대 3밀리리터를 0.5%BSA로 추가합니다.
거품을 피하기 위해 위아래로 파이프를 사용하여 셀을 다시 중단합니다. 40 마이크로미터 여과기를 통해 세포 현탁액을 걸게 하고 즉시 BSA 그라데이션에 셀을 적재합니다. 셀을 그라데이션에 로드하기 전에 균일한 단일 셀 서스펜션을 받아야 합니다.
응집 된 세포는 퇴적물을 더 빨리 하여 그라데이션을 방해하고 분수를 오염시합니다. 50 밀리리터 튜브를 얼음 위에 수직으로 설치하여 튜브의 한쪽을 볼 수 있는지 확인합니다. 그런 다음 10 밀리리터 세로지컬 파이펫 끝에서 약 5~10밀리미터를 자르고 파이펫 컨트롤러에 장착합니다.
50 밀리리터 튜브 의 바닥에 5 % BSA 솔루션의 파이펫 5 밀리리터. 파이펫의 절단 팁으로 5% 용액의 표면을 부드럽게 터치하고 5% 용액 위에 4%BSA 용액의 5밀리리터를 천천히 층으로 세게 층. 다른 BSA 솔루션과 이 절차를 반복하여 5%에서 1%BSA의 그라데이션을 얻습니다.
레이어 사이에 선명한 선이 표시되어야 합니다. 그런 다음 교란하지 않고 그라데이션 위에 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 로드합니다. 세포 퇴적물을 1시간 반 동안 그라데이션을 통과하게 한다.
컷 파이펫 팁을 사용하여 1밀리리터 분획을 별도의 1.5 밀리리터 튜브로 조심스럽게 수집하고 얼음에 저장하여 수집된 순서대로 튜브의 번호를 확인합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 600 x g의 세균 세포 분획을 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않도록주의하고, 대부분의 상체를 버리고 튜브를 가볍게 하여 세포를 다시 중단하십시오.
각 튜브에 얼음 차가운 1X KREBS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 원심분리를 반복합니다. 대부분의 상체를 버리고 약 100 마이크로리터를 남기고 세포 펠릿을 조심스럽게 재보힙시다. 세포 분획을 분석하려면 번호가 매겨진 현미경 슬라이드에서 각 그리스 펜 링 내부에 4%파라포름알데히드의 20 마이크로리터를 파이프팅하여 시작합니다.
해당 분획에서 재중단된 셀의 마이크로리터 2개를 즉시 추가합니다. 그런 다음 실온에서 슬라이드를 적어도 한 시간 동안 건조시십시오. PBS로 슬라이드를 한 번 헹구고 DAPI가 장착된 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
형광 현미경의 밑에 각 슬라이드를 분석하여 각 분획에서 농축되는 특정 세균 세포 모형을 추정합니다. 각 분획에서 샘플이 현미경 검사법을 위해 채취되면, 각 분획에 얼음 차가운 1X KREBS1 밀리리터를 추가하고 4°C에서 10분 동안 세포를 600~ 13000 x g로 원심분리합니다. 상체를 제거하고 폐기하고 기본 다운스트림 분석을 계속합니다.
이 프로토콜은 둥근 정자를 풍부하게하는 데 특히 적합합니다. 90% 이상의 농축은 2, 3, 4분단위로 달성되었다. 긴 정자는 그라데이션의 상단에 머물 경향이 첫 번째 분획으로 수집되었다.
그들의 큰 크기 때문에, pachytene 정자 세포 퇴적물 빨리 마지막으로 수집 되었다. 농축은 분수 14와 15에서 약 75 %였습니다. 분획의 대다수에서 얻은 총 RNA는 0.5에서 2.5 마이크로그램에 구역 수색, 다운스트림 RNA 분석에 충분.
각 분획에서 얻은 단백질의 양은 전형적으로 20에서 140 마이크로그램사이로, 이는 몇몇 서양 얼룩에 충분합니다. 이 프로토콜에서 단일 분획에서 파생된 단백질 리자테의 10%는 표준 서양 블롯에서 DDX4, PIWIL1 및 PIWIL2 단백질을 명확하게 검출하기에 충분했습니다. 1분분의 단백질의 양은 또한 PIWIL1에 대하여 항체를 이용한 면역 침전및 coimmuno침전형 PIWIL2의 검출을 위해 충분했다.
첫 번째 타이머의 경우에도 이 프로토콜은 셀의 사전 치료가 양호하고 퇴적물 중에 그라데이션을 방해하지 않는 한 매우 잘 작동합니다. 단일 마우스에서 RT-PCR, RNA 염기서열 분석, 면역 침전 및 서양 블로팅과 같은 다른 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 고농축 세포를 얻을 수 있습니다. MDR은 남성 세균 세포를 풍부하게하는 유일한 방법은 아니지만 특수 장비 나 광범위한 교육이 필요하지 않기 때문에 매우 편리한 도구입니다.
