이 프로토콜은 조류 재생에 있는 그들의 생리적 인 역할의 추가 조사를 위해 조류 계란에서 각막 하위 층을 샘플링하는 단계별 절차를 제공합니다. 각 단계에서 샘플링을 최적화하여 구조적 및 분자 손상을 제한하고 있습니다. 이 프로토콜은 심층 적인 프로테오믹스를 위해 더욱 개발되었습니다.
새로 배치된 수정되지 않은 계란에서 각성 층 또는 PL을 샘플링하여 시작합니다. 달걀을 부수고 달걀 분리기를 사용하여 노른자를 흰자에서 분리합니다. 작은 가위로 샬라자에를 제거하고 노른자를 필터 용지 위로 굴려 투명하지만 눈에 보이는 구조로 나타나는 부착 된 알부민을 제거합니다.
이전에 섭씨 4도까지 냉각된 pH 8에서 10 밀리머 트리스 HCL이 들어있는 결정화기에 노른자를 담그고 무딘 가위를 사용하여 1 센티미터 영역 내에서 발아 디스크를 통해 PL 영역을 제거하십시오. 버퍼 내부에 작은 가위로 PL을 파열한 다음 파열된 PL의 두 가장자리를 집게하여 떼어냅니다. 노른자의 흔적이 보이지 않는 때까지 10 밀리머 트리스 HCL의 목욕에서 PL을 여러 번 헹구는다.
PL이 버퍼에 깨끗하고 흰색이며 부동되어 있는지 확인합니다. 서브레이어 분리를 위한 PL을 처리하거나 생화학적 분석으로 직접 진행한다. OPL과 IPL을 분리하려면 10 밀리머 트리스 HCL과 50 밀리머 나트륨염화로 채워진 플라스틱 페트리 접시에 OPL을 향하여 전체 샘플을 확산하고 가능한 한 적은 주름으로 평평하게 유지하십시오.
OPL에만 연결된 나머지 샬라자의 위치를 결정합니다. 그런 다음 전체 PL을 작은 가위로 약 2~ 3센티미터의 조각으로 자른다. 해부 현미경으로 초정밀 팁 집게로 두 층을 기계적으로 분리합니다.
결과 IPL 및 OPL 샘플을 음의 섭씨 80도에서 마이크로 튜브에 개별적으로 저장하여 추가 사용까지 보관하십시오. 1차 단백질 용해화를 수행하기 위해 IPL 및 OPL 샘플을 개별적으로 동결하여 남은 물을 제거한 다음 각 샘플에서 약 1밀리그램을 자르고 누출 방지 나사 캡을 사용하여 깨끗한 마이크로 튜브 내부에 배치하십시오. 나머지 샘플을 단단히 닫힌 튜브에 보관하여 음수 20도 또는 음수 80도에서 장기간 보관하십시오.
pH 7 및 500 밀리머 나트륨 염화 나트륨에서 50 밀리머 트리의 400 마이크로 리터와 각 lyophilized 하위 층의 1 밀리그램을 혼합합니다. 믹서 밀을 30 Hertz에서 5분 동안 두 번 사용하여 구조를 미세 입자로 분해하고 단백질 용해화를 용이하게 합니다. 400 마이크로리터의 마이크로리터를 두 개의 깨끗한 마이크로 튜브로 수집합니다.
전기 포에 대한 샘플을 준비하려면 각 400 마이크로 리터 샘플에 5X SDS-PAGE 샘플 버퍼를 추가하고 5 분 동안 섭씨 100도로 가열하십시오. 4-20% 그라데이션 SDS 폴리아크릴아미드 젤의 각 레인에 최대 20마이크로그램의 단백질을 적재하고 120볼트에서 전기포전을 수행합니다. 전기포고후, 유리판에서 젤을 제거하고 30분 동안 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색한 다음, 젤 배경이 밝은 파란색으로 나타날 때까지 50%의 물, 40%에탄올 및 10%의 아세트산으로 구성된 용액으로 염색합니다.
젤을 탈염색 및 재수분 공급을 위해 탈온화된 물을 함유한 페트리 접시에 옮기습니다. 단백질은 투명한 배경을 가진 파란색 밴드로 나타나야 합니다. PL은 최소한의 단백질 손실과 최적의 하위 층 분리를 허용하는 조건을 확인하기 위해 다양한 버퍼를 실시하였다.
다양한 트라이농도에서 방출되는 단백질, pH 및 염화나트륨 농도가 여기에 나와 있다. 결과 2개의 하위층은 해부 현미경의 밑에 관찰되었다. IPL은 반투명하고 OPL은 조밀하고 흐리며 희끄러합니다.
분리 후 OPL및 IPL은 독립적으로 lyophilized되었고 단백질 함량은 기계적 연삭, 애니메이션 세제, 환원제 및 끓는 조합을 사용하여 완전히 용해되었습니다. 샘플은 폴리 아크릴아미드 젤에 뚜렷한 전기 전광 프로파일을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때, 하위 층의 분리는 절차의 중요한 단계이며 최소한의 염 농도를 포함하는 완충액에서 쌍안경 현미경을 사용하여 수행해야한다는 것을 명심하십시오.
각각의 생리적 기능을 더욱 해명하기 위해, 경막 서브레이어 샘플은 전자 현미경을 이용한 조직학적 특성화 및 이미징 분석 및 세포 이동을 이용한 기능적 연구를 위해 분석될 수 있다.
