이 프로토콜은 학생들이 개별 감염을 명확하게 식별하고 분석을 쉽게 수행 할 수 있도록 도와 주므로 바이러스 역가를 정량화하는 것이 더 효율적입니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차를 통합합니다. 이 방법은 질병에 대한 항 바이러스 치료의 정확성과 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 플라킹 프로토콜의 더 어려운 장애물은 플레이트를 시드하는 세포 수이며, 세포가 과밀, 건조 또는 프로세스 전반에 걸쳐 긁히지 않도록합니다. 또한이 프로토콜의 전반적인 세심한 특성에서 어려움을 겪을 수도 있습니다. 그러나 연습은이 실험의 성공의 주요 기여자입니다.
시작하려면 한 실험실 세션에서 세포에 바이러스를 첨가하여 샘플 희석을 완료하십시오. PBS로 플라크되는 각 바이러스 샘플을 연속적으로 희석한다. 일반적으로 가장 정확한 추적을 위해 10배 희석을 사용합니다.
이러한 희석된 바이러스 샘플을 세포에 추가할 준비가 될 때까지 모든 바이러스 희석액을 얼음 위에 보관하십시오. 피펫을 사용하여 하나 또는 두 개의 웰에서 세포 배양 배지를 제거한다. 조심스럽게 희석된 바이러스 샘플을 세포의 각 단층에 적하하여 각 웰의 측면을 통해 적가한다.
전체 플레이트가 플라크되는 바이러스 샘플로 채워질 때까지 하나 또는 두 개의 웰마다 이 과정을 반복하십시오. 접시 전체를 손으로 부드럽게 흔든다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션하여 바이러스 흡착을 허용하십시오.
10분마다 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 다시 부드럽게 흔들어 각 웰에 바이러스를 더 고르게 퍼뜨린 다음 다시 인큐베이터에 놓습니다. 실수로 흡수되지 않은 접종물을 세는 가능성을 줄이려면 1000 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 웰에서 바이러스 샘플을 제거하고 샘플을 폐기물 비이커에 버리십시오. 2.5 밀리리터의 메틸 셀룰로오스 오버레이를 플레이트에 놓고 인큐베이터에 다시 놓습니다.
폐기물 비이커를 소독하십시오, 일반적으로 표백제, 요오도포어 또는 유사한 virucide를 첨가하여 생물 안전 캐비닛에서 제거하십시오. 이틀 인큐베이션 후, 피펫을 사용하여 한 번에 하나 또는 두 개의 웰로부터 메틸셀룰로스 오버레이를 제거하고, 이를 폐기물 비이커에 놓는다. 각 웰에 50 % 에탄올에 약 2 밀리리터의 1 % 크리스탈 바이올렛을 첨가하십시오.
얼룩으로 채워진 모든 웰로 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 시점에서 이전에 입증 된 것처럼 폐기물 비커를 소독하십시오. 유출이 맑을 때까지 수돗물로 접시를 격렬하게 씻으십시오.
각 희석 시리즈에 걸쳐 플라크 수에 약 10배 차이가 있는지 확인하십시오. 이 그림은 세 번의 반복실험 모두에 대해 셀 수 있는 플라크 수가 10에서 마이너스 네 범위로 떨어지는 플라크 수의 10배 감소를 보여줍니다. 그림의 처음 세 이미지는 10에서 마이너스 세 희석까지의 플라크를 묘사합니다.
그러나 하단 행은 플라크 분석이 잘 수행되지 않은 경우 결과를 보여줍니다. Vero 세포가 기질에서 완전히 들어 올려진 상단 주변의 가시적 인 영역에서 희석 된 플라크는 거의 없습니다. 유사하게, 이 그림은 플라크 분석 동안 세포가 건조되거나 잘못 취급되는 문제를 보여준다.
그러나이 수치는 빈약 한 베로 세포 시딩을 비판적으로 보여줍니다. 모든 우물은 더 짙은 보라색 반점을 보여 주며, 세포가 우물을 가로 질러 잘 퍼지지 않고 클러스터에서 서로 위에 쌓여 있음을 나타냅니다. 최상의 결과를 얻으려면 바이러스가 플레이트 전체에 균일하게 확산되어 플라크 분석이 살아있는 바이러스 만 계산하기 때문에 다른 정량적 방법보다 더 효과적입니다.
그렇게하면 진정한 항 바이러스 효능이 확립 될 수 있습니다. 또한,이 기술을 통해 우리는 fomite에 대한 바이러스 존재를 정량화하고 헤르페스 바이러스 연구 분야의 새로운 의료 기기에서 약물 전달의 효과를 탐구 할 수있었습니다.
