Zebrafish는 척수 손상에서 회복 할 수있는 능력 때문에 귀중한 신경 재생 모델을 제공합니다. 이 방법은 수영 지구력과 수영 행동을 기능적 척수 복구의 판독으로 설명합니다. 이 기술은 성인 제브라 피쉬의 수영 지구력과 수영 행동에 대한 신뢰할 수 있고 정량화 가능한 평가를 제공합니다.
이러한 방법은 신경 근육 및 근골격계 발달, 질병 및 재생에 대한 연구에 동일하게 적용됩니다. 수영 지구력을 평가하려면 유속 제어 소프트웨어를 엽니 다. 실험이라고 표시된 상자를 클릭하고 Uswim과 Uwater의 선택을 취소하십시오.
그런 다음 왼쪽 하단의 Uwater 박스의 유량을 변경하여 물 전류 속도를 조정하십시오. 자동화된 프로토콜을 시작하려면 로깅 시작 상자를 클릭합니다. 대화 창이 열리면 드롭다운 목록에서 자동화를 선택합니다.
이전에 저장한 프로토콜 파일을 열려면 프로토콜 파일 옆에 있는 파일 아이콘을 클릭합니다. 그런 다음 로그 파일 옆에있는 파일 아이콘을 클릭하여 출력 파일을 설정하십시오. 파일 탐색기 창이 열리면 출력 파일의 이름을 지정하고 원하는 위치에 저장합니다.
그런 다음 분할 랩 타이머 창을 설정하여 컴퓨터 화면의 유속 제어 소프트웨어 및 타이머 창에 동시에 액세스할 수 있도록 합니다. 다음으로, 수영 터널에서 제거 된 후 지친 물고기를 수용 할 물고기 수집 탱크를 설치하십시오. 수집 탱크와 긴 폴리 염화 비닐 튜브를 제브라 피쉬 시스템 물로 채 웁니다.
미리 채워진 튜브의 한쪽 끝을 수집 탱크에 놓고 버퍼 탱크에 다른 쪽 끝을 배치하여 물이 버퍼 탱크에서 수집 탱크로 자유롭게 흐를 수 있도록하십시오. 물의 흐름을 방지하기 위해 바인더 클립으로 튜브의 상단부를 클램프하고 필요에 따라 바인더 클립을 사용하여 물의 유출을 제어하십시오. 수영 터널 안에 물고기 한 그룹을 배치하기 전에 수영 지구력 뚜껑으로 수영 터널을 닫으십시오.
물고기를 수영 터널과 흐름 방향에 적응시키려면 분할 랩 타이머를 시작하고 처음 다섯 분 동안 초당 0 센티미터, 다음 다섯 분 동안 초당 9 센티미터, 다음 다섯 분 동안 초당 10 센티미터로 현재 속도를 조정하십시오. 순응 후 프로토콜을 열고 자동 유속 제어 프로그램을 시작하여 물 전류 속도를 분당 초당 두 센티미터 씩 증가시킵니다. 물고기가 고갈되었는지 모니터링하십시오.
지친 물고기는 수영 터널의 뒤쪽 끝으로 밀려납니다. 물고기가 고갈되도록하려면 터널의 뒤쪽 끝을 부드럽게 두드리거나 그 지역 위에 그림자를 만들어 물고기가 수영하도록 자극하십시오. 지친 물고기는 깜짝 놀랄만한 자극에 반응하지 않았고 터널의 뒤쪽 끝에 평평하게 누워있었습니다.
물고기가 고갈되면 물고기 수집 튜브의 클램프를 해제하십시오. 수영 터널 창문을 열고 수집 탱크에서 물고기를 수집하십시오. 스플릿 랩 타이머를 사용하여 고갈 시간을 기록하십시오.
모든 물고기가 고갈되어 수집 탱크에 수집 된 후 유속 제어 소프트웨어의 비상 정지 버튼을 클릭하고 타이머를 중지하십시오. 수영 행동 분석을위한 영화를 캡처하려면 수영 터널에 물고기 그룹을 놓고 완전히 밀폐 된 표준 뚜껑을 사용하여 터널을 닫으십시오. 그런 다음 새 기록 창을 열고 파일 이름을 지정합니다.
아직 녹화를 클릭하지 마십시오. 새로운 실험을 시작하기 전에 수영 터널 측면에 종이 타월 또는 직물 조각을 놓아 모든 행동이 물고기 수영으로 인한 것이지 환경에서의 움직임으로 인한 놀라운 반응 때문이 아닌지 확인하십시오. 물이 차분하고 잔물결이 프레임을 가로 질러 움직이지 않는지 확인한 후 카메라 소프트웨어 창에서 녹화를 클릭하여 동영상 파일 녹화를 시작하십시오.
그런 다음 유속 제어 소프트웨어에서 시작을 클릭하여 프로토콜을 시작하면 중단없이 계속됩니다. 영화를보고 프레임이 떨어지지 않고 시야에 거품이 없으며 모든 물고기가 기록되도록하십시오. 동영상 녹화가 완료되면 비상 정지를 클릭하여 유속 제어 프로토콜을 종료하고 데이터 출력 파일이 자동으로 저장되는지 확인하십시오.
그런 다음 녹화 창을 닫아 동영상 파일을 저장합니다. 녹음 후 뚜껑을 제거하십시오. 조심스럽게 물고기를 회수하여 탱크로 돌려 보내십시오.
캡처한 동영상을 분석하려면 tracking_v2을 엽니다. 피지에서 ijm 스크립트를 클릭하고 실행을 클릭하여 프로그램을 시작하십시오. 팝업 창에서 추적 할 수영 행동 영화가 포함 된 폴더를 선택하고 열기를 클릭하십시오.
첫 번째 영화, 대화 상자 및 관심 지역 또는 ROI 관리자 중 하나의 프레임을 찾으십시오. 대화 상자에 주어진 지시 사항을 따르고 수영 터널 챔버 하단에 ROI를 작성하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하고 검은 색 모서리가 보이지 않는지 확인하십시오.
임계값 창이 편집된 임계값 프레임 창과 함께 열립니다. 색상 구성표를 흑백에서 빨간색으로 변경하고 프레임 하나가 물고기를 빨간색으로 표시 할 때까지 최대 값을 조정하고 다른 것은 표시하지 않습니다. 임계값을 기록하고 대화 상자에서 확인을 클릭합니다.
설명 통계를 정렬, 어셈블 및 획득하려면 SwimBehavior_v7-3을 엽니다. RStudio의 R 스크립트를 클릭하고 스크립트 섹션의 오른쪽 상단 모서리에있는 소스를 클릭하십시오. 새 창이 열리면 _raw가 들어 있는 폴더를 선택합니다.
피지에서 생성 된 csv 파일을 클릭하고 열기를 클릭하십시오. 프로그램이 자동으로 실행됩니다. 팝업 대화 상자에서 각 영화의 물고기 수를 확인합니다.
주어진 숫자가 정확하면 예를 클릭하고, 숫자가 올바르지 않으면 아니오를 클릭하십시오. 파일이 정렬되면 새로 생성된 _aligned을 확인합니다. csv 파일.
프로그램이 데이터를 결합하고, 통계를 실행하고, 출력 그래프를 플로팅하는지 확인한 후 _raw가 포함된 상위 폴더 내의 결과(Results)라는 레이블이 지정된 새 폴더에 생성된 분석 파일을 확인합니다. csv 및 _aligned. csv 파일.
부상 후 두 주, 네 주 및 6 주에 평가 된 수영 지구력은 2 주에서 수영 지구력의 60 % 손실을 나타 냈습니다. 재생되는 물고기는 부상 후 사육 주에 점차적으로 수영 지구력을 회복했습니다. 수영 거동 분석에서, 대조군은 상승된 Y 위치에 대응하는 수영 터널 챔버의 앞 부분에서 꾸준히 수영한다.
대조적으로, 부상 후 두 주 동안, 부상당한 물고기는 현재에 대해 꾸준한 수영 능력을 유지할 수 없었습니다. 결과적으로, 그들의 수영 트랙은 더 불규칙하며 Y 위치가 전반적으로 감소합니다. Y 위치는 부상 후 사육 주에 증가하여 재생 동물이 점차 수영 능력을 회복했음을 나타냅니다.
또한, 부상을 입지 않은 대조군에 비해 부상 후 두 주 동안 병변 동물은 현저하게 덜 활동적이었고, 수영 터널의 뒤쪽 사분면에 정체되어 저전류 속도에서 수영 할 수있는 능력을 잃었습니다. 기능적 회복을 달성하는 타고난 능력과 일관되게 병변 된 동물은 부상 후 네 주와 육 주에 점차적으로 수영 행동 매개 변수를 정상화했습니다. 이 프로토콜에서 유속 제어 소프트웨어를 사용하는 것은 선택 사항입니다.
대안은 수동으로 물 전류 모터를 제어하는 것입니다. 본 연구에 기술된 검정은 신경, 근육 또는 골격 표현형을 사전 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 관심있는 조직을 조직학적 또는 분자 검사를 위해 수확할 수 있습니다.
우리 실험실과 다른 사람들은이 프로토콜을 사용하여 선천적 인 신경 복구에 필요한 유전자와 신경 재생을 향상시키기에 충분한 요인을 확인했습니다.
