우리는 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대한 세계 참조 센터의 직원을 인정 : 박사 로버트 테시, 힐다 구즈만, 박사 케네스 플랜테, 박사 제시카 플랜트, 디오나 샤튼, 그리고 디비야 미르 찬다니, 큐레이팅및 우리와 다른 그룹의 능력 실험에 사용되는 바이러스 균주의 많은 을 제공하는 그들의 지칠 줄 모르는 작업에 대한. 제시된 작품은 맥러플린 펠로우십 펀드(SRA)와 NIH 보조금 AI120942 및 AI121452에 의해 지원되었다.

이러한 프로토콜에서 수행된 모든 절차는 기관 생물 안전 위원회와 갤버스턴에 있는 텍사스 대학 의료 지점의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜을 완전히 준수하여 수행되었습니다.
1. 베로 셀에서 ZIKV 증폭
<ol><li>베로 세포(CCL-81 또는 VeroE6)는 덜벡코의 이글의 최소한의 필수 매체(DMEM)를 10% v/v 열불성 태아소 혈청(FBS)으로 보충하고, 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL 및 10g/mL)을 분해합니다. 각각) 가습37°C 인큐베이터에서 5%CO2에서 80-90% 사이를 150cm2 조직 배양 플라스크로 결합한다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛 (BSC)에서, 배지를 제거하고 10 % 표백제 또는 이중 사위 암모늄(재료의 표)의작업 희석 중 하나에서 폐기한다. 즉시 세포 당 0.1-1 전염성 바이러스 입자를 목표로, 바이러스 육수의 1 mL로 단층을 접종. 무접종이 단층 전체에 닿을 수 있도록 플라스크를 즉시 교반한다.</li>
	<li>2% v/v 열비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-연쇄 절제술을 보충한 DMEM을 사용하여 배지를 5mL의 부피로 위로 올려주세요. 그런 다음 플라스크를 가습된 37°C 인큐베이터로 이동하여 60분 동안 5% CO2를 입력합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 BSC로 가져옵니다. 2% v/v 열 비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-연쇄 절제술을 보충한 DMEM을 사용하여 총 15mL의 총 부피에 배지를 추가합니다. 플라스크를 가습된 37°C 인큐베이터로 5% CO2로이동한다.</li>
	<li>세포 병 증 효과의 증거에 대 한 위상 대비 현미경 검사에서 매일 플라스크를 검사 (CPE). 세포의 약 40-50%만이 단층층에 남아 있을 때 바이러스 수확(step 1.7)으로 진행하며, 일반적으로 3-5일 후감염후체가 활용되고 있는 것으로 나타났다.</li>
	<li>수퍼내를 흡인하고 50mL 원물 바이알에 배치합니다. 원심분리(3,500 x g 20분)로 셀룰러 파편의 상부를 명확히 한다. 참고: 여러 플라스크가 동일하게 감염된 경우 여러 플라스크의 슈퍼나티를 50mL 원추형 튜브로 결합할 수 있습니다.</li>
	<li>50mL 원뿔관에서 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상체관을 새로운 튜브로 제거합니다. 열 비활성화 FBS를 30%(v/v)의 최종 농도로 보충합니다. Aliquot 개별 나사 캡 튜브에이 혼합물을 보고 사용 될 때까지 -80 °C에서 동결.</li>
</ol>2. 인공 혈액 식 준비
<ol><li>당일 모기는 전염성 혈류에 노출되어야 하며, 수유장치(재료표)가모기가 노출될 때까지 예열되는 것을 하는 절지동물 봉쇄 시설에서 전원(재료표)을 켜야 한다.</li>
	<li>아래에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 인공 혈액식을 준비하십시오.<ol>
<li>방법 1: 신선하게 수확된(1주일 이내에) 상업적으로 구입한 1:1 v/v의 혈액을 바이러스 성 육수와 결합합니다(섹션 1에 설명된 대로 준비). 참고: 이 방법은 혈액에 존재하는 바이러스/바이러스 가족에 어떤 항체의 부재에 우발적입니다.</li>
		<li>항체의 부재를 확인할 수 없거나 혈액 공급원이 이전에 flavivirus 노출을 갖는 것으로 알려져 있는 경우, 세척 및 수동으로 적혈구를 포장.<ol>
<li>BSC에서, 50 mL 원판 관에 전체 인간의 혈액의 30 mL을 추가하고 인산완충식식염수 (PBS)와 최대 50 mL를 얹습니다.</li>
			<li>원심 분리기 3,500 x g에서 20 분 동안.</li>
			<li>10% 표백제를 함유한 트레이 팬에 부드럽게 붓거나 이중 사위 암모늄을 희석하여 적혈구 펠릿을 버리지 않도록 주의하여 초퍼를 흡습하십시오.</li>
			<li>PBS의 10 mL을 추가하고 부드럽게 적혈구 펠릿이 재구성 된 있도록 BSC의 바닥에 원적 튜브의 바닥을 누릅니다. PBS로 서스펜션의 볼륨을 최대 50mL까지 가져옵니다. 부드러운 반전으로 섞으세요.</li>
			<li>2.2.2.1−2.2.2.2.4 총 4-6x를 반복합니다. 상체가 명확하거나 약간 분홍색이며 더 이상 불투명하지 않은지 확인합니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여 모든 상체를 제거합니다. PBS의 1-2 mL에서 적혈구 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
			<li>혈중 밀 조립: 포장 된 적혈구 350 μL, 100 μL 100 μL 10% 자당, 200 μL 의 열 비활성화 FBS, 900 μM 재조합 ATP, 2 mL의 DMEM을 사용하여 적절하게 희석 된 바이러스 재고 2 % v / v 열 비활성화 FBS, 1 % (v/v-펜)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염되지 않은마우스의피부와 표준 3mL 저수지 단위(재료 표)를 오버레이합니다(다른 옵션으로는 파라핀 필름, 콜라주공 막 또는 소시지 케이스포함).</li>
	<li>덮인 저수지를 흰 종이 타월에 놓습니다. 한 번에 1mL의 저수지에 전염성 혈밀의 ~2mL를 넣습니다. 누설의 증거를 피더 아래 수건을 검사합니다. 누출이 있는 경우 피더에서 피밀을 회수하고 덮개를 폐기하십시오. 플러그로 피더를 밀봉합니다. 누출이 없는지 다시 한번 확인합니다.</li>
</ol>3. 혈중식사/플라크 분석의 백티션
<ol><li>준비된 블러드밀의 남은 부피를 사용하여, DMEM을 사용하여 10배 직렬 희석 시리즈(즉, 희석된 10x에서 1,000,000x까지) DMEM을 사용하여 2% v/v 열비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-streptomycin을 수행한다.</li>
	<li>가장 희석된 에서 가장 농축된 24 또는 12개의 우물 판으로 희석의 Aliquot 100 μL.</li>
	<li>37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 1h의 인큐베이션을 위해 인큐베이션합니다.</li>
	<li>1 h 인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트를 BSC로 다시 가져와 서 메틸셀룰룰로오스 오버레이 1mL 또는 2mL를 24웰 또는 12개의 웰 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>오버레이 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 3-7일 동안 배양한다(바이러스 변형 에 의존).</li>
	<li>인큐베이션을 따라 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 BSC로 가져옵니다. 메틸셀룰로오스 오버레이를 10% 표백제 또는 이중 사분위 암모늄 소독제가 들어 있는 트레이 팬에 넣습니다.</li>
	<li>PBS로 2배 씩 잘 씻고, 10% 표백제 또는 이중 사분위 암모늄이 들어 있는 트레이 팬에 세척을 폐기합니다.</li>
	<li>메탄올:아세톤(1:1 v)의 ~1mL를 추가하고 실온(RT)에서 BSC에서 최소 30분 동안 세포가 플레이트에 고정되도록 합니다. 유기 폐기물에 대한 제도적 정책에 따라 메탄올 : 아세톤을 폐기하십시오.</li>
	<li>아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 ZIKV를 시각화합니다.<ol>
<li>메탄올제거에 이어 5분 동안 크리스탈 바이올렛 액액(0.25%w/v/v/v30%)으로 즉시 얼룩을 제거하였다. 수돗물에 2x를 헹구고 건조하게 두근 다음 눈으로 직접 눈으로 시각화하여 플라크 또는 모노레이어파괴의 증거를 제시합니다.</li>
		<li>또는 초점 형성 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>유기 고정이 남아있을 때까지 접시가 건조하게 하십시오. 참고: 이것은 BSC 외부에서 ~ 2-3 h가 걸리지만 BSC 또는 화학 연기 후드에서 공기 건조로 가속 될 수 있습니다.</li>
			<li>비멸 성 PBS (Mg2 + 및 Ca 2+ 무료)에서 각 우물을 3x3x로 세척하십시오. PBS를 제거하고 각 웰에 블로킹 솔루션(PBS + 3% FBS)을 추가하고 RT에서 15분 동안 바위를 추가합니다.</li>
			<li>블로킹 용액에서 α-ZIKV 또는 α 플라비바이러스 1차 항체(예: 플라비바이러스 그룹 hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2])의 웰당 100 μL을 추가합니다. RT에서 최소 4 시간 (바람직하게는 하룻밤, 18 h를 초과하지 않음)에 대한 흔들로 배양하십시오.</li>
			<li>기본 항체를 제거하고 궤도 플레이트 로커에서 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무료)로 각각 15분 동안 3배 세척합니다.</li>
			<li>차단 버퍼에 희석된 이차 항체(염소 α 마우스 HRP 라벨)의 우물당 100 μL을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 흔들로 인큐베이션하십시오.</li>
			<li>궤도 플레이트 로커에 PBS (Mg2 + 및 Ca 2+ 무료)와 함께 각각 15 분 동안 3 배 세척하십시오.</li>
			<li>염기판 개발 시약의 Aliquot 100 μL(재료의 표)잘 당. 15 분 동안 RT에서 바위 접시.</li>
			<li>기판을 제거하고 수돗물로 플레이트 2x를 헹구어 포시/플라크의 발달 시 반응을 중단합니다. 수돗물을 붓고 정량화하기 전에 접시가 건조하게 하십시오.</li>
			<li>주어진 샘플에 존재하는 FFU의 수를 결정하기 위해 바이러스 성 포시를 카운트.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 혈중식 관리
<ol><li>Ae. aegypti 모기 2-4 일 포스트 백과를 사용하십시오. 여성 모기를 0.5 L 골판지 판지 팩에 가려진 뚜껑으로 분류하고 설탕을 박탈하십시오 (일반적으로 36-48 h 전 전염성 혈밀). 수분 포화 면공을 통해 광고 리비툼 물을 제공합니다.</li>
	<li>모기가 전염성 혈중에 노출될 것이라는 아침에 수분포화 면공을 제거하십시오.</li>
	<li>투명한 플라스틱 장갑 상자 안에 인공 혈액식이 포함된 저장소를 먹이 장치에 부착합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 0.5L 골판지 상자에 50-100개의 굶주린 Ae. aegypti 모기가 들어 있는 스크리닝 된 뚜껑이 있는 0.5 L 골판지 상자를 저수지에 부착된 먹이 장치 아래에 놓습니다. 참고: 적절하게 굶주리고 있는 모기는 일반적으로 20분 이내에 먹이를 줄 것입니다. (ZIKV) 바이러스 성 티터가 ~60 분 후에 피더 내에서 감소 할 수 있기 때문에, 이 60 분 이상 연장해서는 안되지만, 느린 인구에서 샘플 크기를 증가시키기 위해 필요에 따라 수유를 연장 할 수 있습니다.</li>
	<li>수유가 완료되면 저수지를 제거하고 갓 만든 10% 표백제에 담급니다.</li>
	<li>-20°C에서 30초 또는 냉장고에서 5분 동안 인큐베이션으로 모기를 냉정한 마취시합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 모기를 얼음 위에 페트리 접시에 붓습니다. 계산하고 unengorged 모기에서 engorged 여성을 정렬합니다. 70%의 에탄올로 채워진 50mL 튜브 원내관에 침수하여 모기를 폐기하십시오. 모기는 여전히 마취되어 있는 동안, 0.5 L 골판지 판지 상자에 다시 붓고 화면과 뚜껑으로 빠르게 덮습니다. 초과 화면 메시를 판지에서 잘라테이프로 메시를 고정합니다.</li>
	<li>각 판지의 화면에 10% 수성 자당을 여과한 멸균으로 포화 된 면 공을 추가합니다. 모든 모기 상자를 습기를 유지하기 위해 젖은 스폰지가있는 대형 플라스틱 보조 용기에 놓습니다.</li>
	<li>모기 판기가 들어 있는 이차 용기는 27± 1°C의 온도(또는 관심 지역의 조건을 시뮬레이션하기 위해 적절하다)에 80%± 상대 습도 및 16:8 광:암사이클)을 넣습니다. 실험이 완료될 때까지 10%의 자당에 대한 광고 리비툼 액세스를 사용하여 모기를 유지하십시오.</li>
</ol>5. 샘플 수집 및 처리
<ol><li>지정된 일 후 먹이에, 장갑 상자 내에서 기계 적 흡인체를 사용하여 적절한 판지에서 모기의 소정의 수를 흡인. 필요한 수의 모기를 획득한 후 면둥근 면으로 수집 튜브를 캡합니다.</li>
	<li>-20°C에서 30초 간 또는 4°C에서 5분간 인큐베이션으로 모기를 마취합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 모기를 얼음 위에 페트리 접시에 붓습니다. 두 쌍의 포셉을 사용하여, 각 모기의 다리 의 모든 6을 제거하고 살균 된 스테인레스 스틸 볼 베어링 (7/32") 및 500 μL의 모기 수집 매체 (MCM)를 포함하는 사전 표지 된 2 mL 둥근 바닥 미세 센심 분리 튜브에 배치, 2 % FBS, 1 % 페니실린 - streptocin, 2 μl</li>
	<li>모기를 미네랄 오일 한 방울에 부드럽게 놓고 제지하고, 오일과 모기의 머리와 프로보시스 사이의 접촉을 허용하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>모기 프로보시스를 10 μL 파이펫 팁에 열 비활성화 FBS 10 μL로 채우십시오. 참고: 또는 파이펫을 자당, 혈액 또는 미네랄 오일로 채울 수 있습니다. 오일은 가벼운 현미경 을 통해 타액 기포의 직접 시각화를 허용합니다.</li>
	<li>모기가 30 분 동안 침을 뱉도록 하십시오. FBS +타액을 함유한 마이크로피펫 팁을 MCM의 100 μL을 포함하는 마이크로센심심분리기 튜브에 배출한 다음, 멸균된 강철 볼 베어링과 500 μL의 MCM을 포함하는 별도의 2mL 원형 하단 미세 센세리후이튜브에 시체를 배치합니다. 바디, 다리 및 타액에 사용되는 튜브가 동일한 모기에서 유래한 세 가지 샘플이 모두 명확하도록 라벨이 부착되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>모기가 침을 흘리는 동안 나머지 모기에 5.3-5.5 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>몸과 다리를 포함하는 튜브를 BSC 내에 포함된 비드 밀링 조직 균질화 장치로 운반한다. 모든 신체 및 다리 샘플을 26Hz에서 5분 동안 세리게 하여 바이러스 성 입자를 상체로 방출합니다. 모든 샘플을 200 x g에서 200 x g로 5분 간 명확히 하여 셀룰러 이물질을 배출합니다. 참고: 이 시점에서 샘플은 -80°C에서 동결되거나 즉시 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 전염성 분석에 의한 ZIKV 검출
<ol><li>BSC에서, 감염성 분석의 개시 전에 베로 세포 (우물 당 105 세포) 24 시간으로 24 개의 잘 조직 배양 판을 준비합니다. 단일 모기/샘플의 ID로 각각 잘 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>샘플이 -80°C에서 동결된 경우 해동을 수 있습니다.</li>
	<li>샘플 한 플레이트를 한 번에 한 접시로 접종하기 전에 베로 셀 플레이트에서 미디어를 제거합니다.</li>
	<li>몸이나 다리를 포함하는 샘플의 경우, 각 우물에 정제 된 수퍼 나탄의 100 μL을 신중하게 알리쿼트하여 펠릿에서 모기 세포 파편을 방해하지 않도록주의하십시오. 참고: 타액 샘플은 필요한 경우 나중에 적정을 위해 샘플을 보존하기 위해 세포에 접종하기 전에 MCM으로 1:1 (v/v)을 희석할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 이동하고 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트를 BSC에 반환하고 각 웰에 메틸셀룰룰로오스 오버레이의 ~1mL을 추가합니다. 오버레이 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 다시 넣고 3-7일 동안 배양합니다(바이러스/변형에 의존).</li>
	<li>3.6-3.9 단계에 설명된 대로 고정 및 시각화를 수행합니다.</li>
	<li>초점 형성 분석서를 통한 채점과 관련하여, 경현미경하에서 검사를 통해 양성 우물을 정량화한다. 우물에서 세포의 intracytoplasmic 염색의 검출은 바이러스의 존재를 나타냅니다. 샘플은 초점 양성 또는 -negative로만 채점됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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여기에 설명된 메서드는 벡터 역량 분석을 수행하기 위한 일반화된 워크플로우를 제공합니다. 일반적인 틀로서, 이러한 방법론의 대부분은 문학 전체에 걸쳐 보존된다. 그러나 수정할 여지가 있습니다(아자르와 위버1에서검토됨). 바이러스(예를 들어, 바이러스 계보, 도전 바이러스의 저장, 바이러스 통로 역사), 곤충학(예를 들어, 모기 집단의 실험실 식민지화, 타고난 면역, 모?...

벡터 능력은 종, 인구, 심지어 개인의 수준으로 정의되며, 모기, 진드기 또는 플렙보토민 모래 와 같은 주어진 절지동물의 능력으로 정의되며, 절지동물1,2에서복제 또는 발달로 생물학적으로 에이전트를 획득 및 전송한다. 모기와 절지동물 매개 바이러스(즉, arboviruses)와 관련하여, 이 에이전트는 여성 모기에 의해 비레믹 숙주로부터 면역을 당합니다. 섭취 후, 바이러스는 중구 상피 세포3의작은 인구 중 하나를 생산적으로 감염시켜야하며, 소화 효소에 의한 프로테오분해분해, 미생물(midgut 감염 장벽 또는 MIB)의 존재, 및 분비된 수막 매트릭스와 같은 다양한 생리적 장애물을 극복해야 한다. 미드구트 상피의 감염은 바이러스의 복제와 모기의 개방 순환 시스템으로 미드구트에서 탈출, 또는 혈청 림프, 미드 구트 탈출 장벽을 극복 전파 감염의 발병을 나타냅니다 (MEB). 이 시점에서 바이러스는 이차 조직 (예를 들면, 신경, 근육 및 지방 바디)의 감염을 확립하고 복제를 계속할 수 있습니다, 비록 그 같은 이차 복제는 타액 땀샘의 아신 세포를 감염하기 위하여 바이러스를 위해 엄격하게 필요하지 않을 수 있더라도 (침샘 감염 장벽을 극복). 타액선 아시나르 세포로부터 의충구멍으로 의한 후 타액 덕트로 이동하면 바이러스를 물고 후속 호스트로 접종할 수 있게 하고, 전송 주기1,2,4,5,6,7을완료한다.
모기 벡터 내에서 확산되는 이러한 특성화되고 일반적으로 보존된 메커니즘을 감안할 때, 실험실 벡터 능력 평가는 프로토콜의 차이가1,2존재하지만종종 방법론적으로 유사합니다. 일반적으로, 경구 바이러스 노출 후, 모기는 중간구체, 다리, 난소, 또는 타액 선반과 같은 개별 조직이 바이러스 감염, 보급 감염, 보급 감염/잠재적 인 트랜스변변성 전염 및 전파 된 감염 /잠재적 인 전송 능력에 대해 분석 될 수 있도록 해부된다8. 타액선에 바이러스의 단순한 존재는, 그러나, 일부 벡터/바이러스조합1,2,4,5,7,9에서타액 선 탈출/송신 장벽(SGEB)의 증거를 감안할 때, 전송 능력의 확실한 증거가 아니다. 전송 능력을 증명하는 표준 방법은취약한동물(10,11,12)에모기 전송을 유지한다. 그러나, 많은 arboviruses에 대해 이 것들은 면역 손상된뮤린모델(13,14,15,16)의사용을 필요로 한다는 점을 감안할 때, 이 방법은 종종 비용 금지이다. 일반적으로 사용되는 대안은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 바이러스 게놈 또는 전염성 입자의 존재를 각각 입증하기 위해 전염되는 분석으로 분석될 수 있는 모기 타액의 수집이다. 이러한 체외 타액 수집 방법은 생체 내 수유 중에 증착된 바이러스의 양을12또는 과소 평가할 수 있으며, 이는 이러한 데이터를 주의해서 해석해야 한다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 체외 방법은 타액에서 바이러스의 단순한 존재의 관점에서 분석할 때 매우 유용하며, 이는 전염 가능성을 나타낸다.
arboviral 질병 발발에 있는 모기 벡터의 역할을 결정하기 위한 2개의 중요한 접근이 존재합니다. 첫 번째 방법은 모기가 활성 전송18,19,20,21,22,23,24의맥락에서 수집되는 현장감시를포함한다. 그러나, 감염률이 전형적으로 매우 낮다는 점을 감안할 때(예를 들어, 미국21에서활성 Zika 바이러스(ZIKV) 순환 영역에서 모기의 감염률 추정0.061% 추정), 잠재적 벡터 종의 유죄 는 1,600명 중 1개에서 감염된 개인을 트래핑 방법론 25,26 및 무작위 확률(예를 들어) 트래핑 방법으로 심하게 편향될 수 있다. . 이를 고려하여, 주어진 연구는 전송에 관여하는 모기를 정확하게 샘플링하기 위하여 원시 수 또는 종 다양성 둘 다에 있는 충분한 모기를 취득하지 않을 수 있습니다. 대조적으로, 벡터 능력 분석은 실험실 조정에서 착수되어 경구 복용량과 같은 매개 변수를 엄격하게 제어 할 수 있습니다. 현장 환경에서 모기 감염 및 전송 능력의 진정한 복잡성을 완전히 대표할 수는 없지만, 이러한 실험실 평가는 arbovirology 분야에서 강력한 도구로 남아 있습니다.
여러 모기 종, 인구 및방법(27,28, 29,30,31,32)에서ZIKV를 통한 다양한 벡터 역량 분석뿐만 아니라 벡터 능력 평가1의최근 검토를 기반으로, 일반적인 벡터 역량 워크플로우와 관련된 몇 가지 프로토콜을 여기에서 설명한다. 이러한 실험에서, 미주 (살바도르의 도시, 브라질; 도미니카 공화국; 그리고 낮은 리오 그란데 밸리, TX, 미국)에서 세 Ae. aegypti 인구는 ZIKV의 단일 변형에 노출되었다 (멕스 1-7, GenBank 가입: KX247632.1) 4, 5, 또는 6 로그10 초점 단위에 의해 인공 요법 이어서, 해부 및 세포 배양 기반 전염 분석등을 통해 다양한 시간 동안 외래 배양(2, 4, 7, 10 및 14일)을 거쳐 감염, 보급감염 및 전송 능력의 증거를 분석하였다. 현재 워크플로/프로토콜은 ZIKV에 최적화되어 있지만, 많은 원소는 절지동물 봉쇄 및 생물 안전 수준 2 및 3(ACL/BSL2 또는 ACL/BSL3)에서 다른 모기 매개 아르보바이러스와 직접 변형될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

제시된 절차는 감염의 비율을 결정하기 위하여 실험실 조건의 밑에 Zika 바이러스를 가진 Aedes aegypti 모기를 감염, 보급한 감염 및 문제의 모기 집단에 있는 바이러스의 잠재적인 전송을 확인하기 위하여 일반화한 방법론을 기술합니다. 이러한 절차는 전 세계적으로 벡터 역량 평가에서 다양한 수정과 함께 널리 활용됩니다. 그(것)들은 주어진모기 (즉, 종, 인구, 개별)가 주어진 에이전트의 전송에서 재생할 수 있는 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요합니다.

Ae의 세 인구. 미주(살바도르, 브라질, 도미니카 공화국; 리오 그란데 밸리, TX, 미국)의 아이집트는 미주(ZIKV Mex 1-7, 치아파스 주, 멕시코, 2015)에서 혈액밀 티터(4, 5, 6 log10 FFU/mL)에서 인공 혈액 세척을 통해 ZIKV의 발병 균주에 노출되었다. 일 2, 4, 7, 10 및 14 소독에서, 모기의 하위 세트는 감염, 보급 및 잠재적 인 전송 속도를 결정하기 위해 처리되었다.
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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K 조회수.  University of Texas Medical Branch. 제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

비디오: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

연구

유전학

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

면역학 및 감염병학

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

생물학

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

형광염염을 사용하여 로다민 B, 남성 Aedes aegypti 모기에서 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위해

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...