이 방법은 세포 구조를 정확하게 식별하기 위해 전체 생물학적 세포에서 슈퍼 해상도 극저온 이미징을 가능하게합니다. 또한 코르스타이트 이미징 워크플로우의 일환으로 다른 양식과 함께 사용할 수도 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초분해능 이미징이 기존의 형광과 상대적으로 낮은 빛 복용량을 사용하여 극저온 조건에서 빠르게 수행 될 수 있다는 것입니다.
CyroSIM은 내부 또는 외부 큐에 대한 응답으로 셀룰러 울트라 구조 역학을 이해하는 데 대한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다. 그 응용 프로그램은 백신 생산 및 출시, 품질 관리, 시장 후 감시, 항체 엔지니어링 및 최적화뿐만 아니라 나노 입자 특성화를 포함한다. 극저온 스테이지 내에서 시료를 기동하는 것은 그리드의 안전을 보장하기 위해 연습이 필요합니다.
또한 데이터 수집 전에 조종석 창의 컨트롤에 익숙해지는 것이 가장 좋습니다. 먼저, 극저온 스테이지의 외부 드와르에서 뚜껑을 제거하고 여과된 액체 질소를 약 1/4까지 부어 넣습니다. 초기 끓는 것이 가라앉을 때까지 기다렸다가 더 많이 붓고 선박을 약 3분의 2로 채웁니다.
액체 질소가 끓어오르면서 핸들러에서 노즐을 가리키며 뚜껑을 조심스럽게 교체하십시오. 액체 질소가 출구에서 나오는 것을 멈추면 극저온 스테이지에 데와르(Dewar) 스테이지 위에 콘센트 파이프를 놓습니다. 전원을 연결하고 USB 케이블을 연결하고 외부 드와르를 스테이지에 연결합니다.
액체 질소의 전달 후, 극저온 스테이지의 방출 버튼을 눌러 샘플 챔버에 들어가고 이미지가 수집되기 전에 시스템이 냉각되고 안정화될 때까지 30~45분 동안 기다립니다. 카세트 도구의 육각 키를 사용하여 샘플 이송 카세트의 두 플레이트를 엽니다. 플레이트를 충분히 넓게 열어 두 플레이트 사이에 그리드를 떨어뜨리지만 최대 위치에 열지는 않습니다.
긴 집게를 사용하여 액체 질소에서 샘플 그리드 상자를 들어 올립니다. 노치가 무대 내부의 저장 위치와 정렬되도록 설정하여 무대에 배치합니다. 적절한 장치를 사용하여 저장소 상자 뚜껑을 올바른 샘플 위치로 엽니다.
반전된 집게를 사용하여 샘플 홀더에서 TEM 그리드를 제거하고 액체 질소 내부에 침지하여 탄소 필름 측이 배치되어 궁극적으로 샘플 브리지의 목표에 직면하고 샘플 이송 카세트의 위치에 놓습니다. 카세트 도구의 육각 키를 사용하여 샘플 카트리지를 닫습니다. 카세트 도구의 자석 점을 사용하여 그리드가 포함된 카트리지를 샘플 브리지에 들어 올리고 장착합니다.
액체 질소에 침지하거나 적절한 방향으로 유지하십시오. 카세트를 다리의 위치 핀 내에 평평하게 놓고 부드럽게 움직이기 때문에 고정되도록 합니다. 남은 샘플과 함께 저장 상자를 닫고 제거합니다.
극저온 스테이지 뚜껑을 이미징 위치로 이동하고 샘플 챔버 라이트를 끕니다. 스테이지를 광학쪽으로 밀어 목표 렌즈 아래에 정렬한 다음, 공을 레버를 사용하여 위치를 부드럽게 떨어뜨려 극저온 스테이지의 뚜껑 내에 있지만 만지지 않도록 합니다. 불투명한 블랙 커튼으로 무대와 광학장치를 덮은 다음 극저온SIM PC에서 제어 소프트웨어 조종석을 시작합니다. 각 카메라의 판독 모드 버튼을 클릭하고 CONV3 메가헤르츠로 설정합니다.
각 카메라의 온도가 섭씨 80도이고 카메라 팬이 꺼져 있는지 확인합니다. 반사된 카메라를 켜고, 빛 아래에서 주변 을 선택하고 linkam 아래에서 콘덴서를 확인한 다음 비디오 모드 버튼을 클릭합니다. 모자이크 뷰 창에서 축소하여 그리드 윤곽선을 확인합니다.
스테이지 찾기를 클릭하고 원 가운데를 두 번 클릭하여 그리드를 중앙에 연결합니다. 위쪽 및 아래쪽 키를 사용하여 그리드 지원 필름 또는 기타 관련 기능이 초점을 맞출 때까지 샘플을 집중합니다. 숫자 패드의 9개 및 3개의 키를 사용하여 Z 단계를 변경합니다.
스테이지가 중심이 되면 비디오 모드를 끕니다. 모자이크 뷰에서 Run 모자이크를 클릭하여 가시광선 모자이크를 수집하여 중앙에서 바깥쪽으로 나선형으로 보이는 가시광선 이미지의 타일을 생성합니다. 모자이크 저장을 클릭하여 뷰를 저장합니다.
밝은 필드 모자이크를 비디오 모드뿐만 아니라 주변 광및 응축기끄기 해제하여 이전 형광 맵 이미지와 함께 브라이트 필드 모자이크를 검사한 다음 필요한 흥분 레이저를 켜고 50 밀리와트에서 50 밀리와트에서 50 밀리와트에서 해당 카메라와 필터를 선택합니다. 0을 눌러 이미지와 별을 자동 대비로 스냅합니다. 또는 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여 콘트라스트를 수동으로 조정합니다.
적절한 형광을 가진 생물학적으로 흥미로운 세포가 발견되면, 모자이크 보기에서 마크 사이트 버튼을 사용하여 자신의 위치를 표시. 이미지 수집을 시작하기 전에 모든 잠재적 사이트를 계속 표시합니다. 파일을 저장 사이트를 클릭하여 표시된 사이트로 모자이크를 다시 저장합니다.
stitchEm 소프트웨어를 사용하여 모자이크 이미지를 스티치하려면 텍스트 모자이크 파일을 확장 BAT로 stitchEm 파일에 드래그앤 드롭하고 모자이크 타일의 결합된 TIF 이미지를 동일한 폴더에 저장합니다. 표시된 사이트와 함께 이미지를 저장하려면 모자이크 텍스트 파일과 마커 텍스트 파일을 동시에 아이콘에 드래그앤드롭합니다. 카메라 뷰 창 하단의 형광 이미지의 개수 및 동적 범위에 따라 레이저 노출 시간을 설정합니다.
각 레이저를 별도로 켜고 사용할 각 파장에 맞게 적용할 필터를 선택하고 최적화합니다. 두 카메라를 클릭하여 켭니다. 표시된 사이트 중 하나로 돌아가 원하는 깊이에 다시 초점을 맞춥니다.
관심 영역에 초점을 맞추면 매크로 스테이지의 XY 창의 최대 화살표 키를 사용하여 포커스를 벗어나 Z 스택의 높이를 선택하여 저장 상단을 클릭합니다. 아래쪽 화살표 키를 사용하여 포커스에서 벗어나 하단 저장을 클릭한 다음 중앙으로 이동하여 이미지가 여전히 포커스가 있는지 확인합니다. 조종석 창에서 단일 사이트 실험을 선택합니다.
드롭다운 목록에서 구조화 조명을 선택합니다. 스택 높이와 1마이크로 미터와 같을 수 있도록 스택 높이를 변경합니다. 반사된 카메라에 대한 405 및 488 나노미터 레이저및 전송된 카메라에 대한 하부 행에 있는 561 및 647 나노미터 레이저에 대한 노출 시간을 상부 열에 대해 밀리초 단위로 노출 시간을 입력합니다.
파일 이름을 입력하고 업데이트를 클릭하여 이전 파일을 재정의하지 않고 날짜와 시간이 포함된 새 파일을 생성한 다음 시작을 클릭합니다. 액체 질소 Dewar가 이미지 수집 중에 극저온 스테이지를 다시 채우면 조종석 소프트웨어의 ABORT 버튼을 클릭하여 프로세스를 중단합니다. 각 위치에서 레이저를 끄고 주변 광및 응축기를 전환하여 가시광선을 사용하여 Z 스택을 수집합니다.
단일 사이트 실험에서 Z 스택을 선택하고 주변 광을 20밀리초 노출로 설정하여 Z 높이를 유지합니다. 표시된 모든 사이트에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 이미징이 완료된 후 스테이지를 도킹 해제하고 모든 샘플을 제거합니다.
샘플 챔버 라이트를 끕니다. 외부 드와르를 분리하고 남은 액체 질소를 다른 냉동 호환 용기에 데워를 분리하여 Dewar가 정상 온도로 안전하게 돌아갈 수 있도록 합니다. 더 이상 액체 질소가 스테이지 Dewar에 남아 있지 않은 후 냉동 단계 디스플레이를 구울 수있는 옵션이 제공 될 때까지 기다립니다.
베이킹 버튼을 눌러 가열 모드로 들어갑니다. 냉동 스테이지에 뚜껑 플러그를 놓습니다. 극저온심의 해상도는 표준 과형현미경검사보다 훨씬 높습니다.
종래의 상피형 현미경으로부터의 형광 맵은 이미징에 대한 관심 영역을 찾는 데 사용될 수 있으며 해당 극저온심 이미지는 그리드의 위치에서 얻을 수 있다. U2OS 세포를 함유한 샘플은 사이토톤골격과 미토콘드리아의 마이크로투룰 성분의 염색을 초래하는 녹색 미세투불 사이토스켈레염색염과 적색 미토콘드리아 염료의 혼합물로 염색하였다. 후속 화상 진찰은 세포 내의 미토콘드리아의 국소화뿐만 아니라 마이크로 투튜의 배열을 보여주었으며, 세포와 세포 골격의 조립에 제공하는 구조적 프레임 워크를 강조했습니다.
SIM 재구성 프로세스는 무료 imageJ 플러그인인 SIMCheck를 사용하여 식별할 수 있는 아티팩트를 생성할 수 있습니다. SIMCheck를 사용하여 생성된 이 변조 대비 맵은 핵 영역 내의 낮은 변조 대비 영역을 보여 주며, 이는 이 영역이 재구성 아티팩트에 더 취약할 것임을 나타냅니다. 흰색 화살표는 재구성 아티팩트를 나타냅니다.
이 프로토콜을 시도할 때 샘플이 침수되거나 항상 액체 질소에 가깝게 유지되어 진동 제거를 방지합니다. 또한 데이터 품질에 영향을 미치고 샘플에 레이저 손상을 방지하기 때문에 동적 범위의 노출 시간과 횟수에주의를 기울입니다. 저온 이미징에 이어, 동일한 샘플은 저온 소프트 엑스레이 단층 촬영과 같은 다른 양식으로 이미지될 수 있으며, B24 Beamline에 있습니다.
냉동심 이미지와 셀에 대한 구조적 정보가 포함된 이미지를 결합하여 셀룰러 초구조 및 기능에 대한 주요 추가 질문에 답할 수 있습니다.
