이 프로토콜은 고가의 특수 장비없이 대부분의 실험실 설정에서 쉽게 적용 할 수있는 옥수수 식물에 직접 바이러스 벡터의 접종을 할 수 있습니다. 직접 접종을 통해 대체 호스트를 접종 소스로 사용할 수 없으며 시간과 리소스를 모두 절약할 수 있습니다. 이 방법은 추가 바이러스 벡터, 옥수수 라인 및 잠재적으로 다른 단응 종에 적용 될 수있다.
먼저 토탄 기반의 성장 매체에 1~2개의 옥수수 씨앗을 채기하여 트레이 안에 놓인 작은 인서트에 넣습니다. 트레이는 섭씨 25도, 섭씨 22~25도, 온실에 16시간 16시간, 8시간 의 밤까지 16시간 미만의 성장실에 놓습니다. 정기적으로 100만 농도당 330개 부품으로 15-5-15개의 액체 비료로 일주일에 한 번 물을 심고 비옥하게 합니다.
항생제로 LB 미디어에서 원하는 바이러스 구조를 포함하는 아그로박테리움 균주를 접종하여 주입을 위한 농균테리움을 준비한다. 그런 다음 225 RPM에서 24 시간 동안 흔들면서 플라스크 또는 튜브를 섭씨 28도에서 배양하십시오. 다음 날, 상온에서 10 분 동안 4, 000 배 G에서 중도화로 박테리아를 펠릿하고 상체를 폐기하십시오.
그런 다음, 탈이온 화 물의 1 밀리리터로 펠릿을 씻으십시오. 10 밀리알 마그네슘 황산염 용액의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 600 나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 1.0으로 조정합니다.
아그로박테리움을 주입하기 위해 4~7일 된 옥수수 묘목을 사용하십시오. 주사기와 바늘을 조립합니다. 세균 현탁액을 콜로틸을 채울 때까지 콜옵틸 노드 위로 2-3 밀리미터를 부드럽게 주입하거나 식물의 성장 단계에 계류 중인 whorl에서 볼 수 있습니다.
모든 묘목을 주입하고 각 구조를 주입하기위한 주사기와 바늘을 변경합니다. 대조군 유전자를 침묵으로부터 병변을 관찰하여 페노티픽 감염을 확인, 잎에 병변 모방 22 또는 식물성 desaturase. GFP 발현의 존재를 검출하기 위해 식물과 형광 현미경 검사의 빠른 스크리닝을 위해 형광 이미징 장치를 사용합니다.
감염의 분자 검출을 위한 유전자 발현 분석을 수행합니다. 감염된 식물의 잎으로부터 총 RNA를 추출14 받는 사람 21 감염 후 일, 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이 첫 번째 가닥 cDNA를 합성. 감염을 확인하고 다른 바이러스 성 구조를 위해 설계된 특정 프라이머를 사용하여 관심의 유전자의 무결성 또는 유전자 단편을 결정하기 위해 역 전사 PCR을 수행합니다.
바이러스 및 유전자 또는 유전자 단편의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 핵산 얼룩을 함유하는 1% 아가로즈 젤에 PCR 제품을 시각화한다. 이 프로토콜은 옥수수 묘목으로 유전자를 위해 설계된 재조합 바이러스를 삽입하는 데 사용되었다. 주사 후 약 12일 동안, 침묵하는 표현형은 괴사및 광표백으로 잎에서 관찰되었다.
감염 후 나뭇잎에서 의 존재는 다른 GFP 필터를 사용하여 형광하에서 녹색 형광 단백질 발현을 관찰함으로써 검출되었다. 여우꼬리 모자이크 바이러스 감염잎의 녹색 형광 단백질 발현은 잎을 가로질러 분포된 형광의 작은 천지 영역과 사탕수수 모자이크 바이러스 감염잎에 큰 패치로 시각화되었다. 유전자 발현 분석을 이용하여, 전신 폭스테일 모자이크 바이러스 감염이 확인되었고, 식물성 desaturase 및 병변 모방(22)의 유전자 침묵 또는 억제가 관찰되었다.
이 구조는 또한 감염 효율에 영향을 미쳤습니다. 폭스테일 모자이크 바이러스 감염의 경우, 폭스테일 모자이크 바이러스 빈 벡터및 폭스테일 모자이크 바이러스 병변 모방(22)은 전형적으로 각각 53%와 54%로 가장 높은 감염 효율을 가졌다. 폭스테일 모자이크 바이러스 파이토엔 데사투라제는 39%에서 약간 낮은 효율로, 폭스테일 모자이크 바이러스 녹색 형광 단백질은 16%로 가장 낮은 효율로, 사탕수수 모자이크 바이러스의 감염 효율은 8%타이밍이고 증상은 사용되는 바이러스 벡터 및 옥수수 라인에 기초하게 될 것이다.
시각적 표현형이 부족하여 침묵이나 표현이 부족하다는 의미는 아닙니다. 이 방법은 또한 가이드 RNA에 대한 전달 방법을 개선하여 유전자 편집 기술에 적용 될 수있다.
