이 프로토콜은 조직학적 분석을 사용하여 마우스 절제 상처의 강력한 형태 측정값을 얻습니다. 이 기술을 사용하여 직렬 섹션의 하위 집합을 사용하여 전체 상처를 분석할 수 있으므로 놓칠 수 있는 결함을 보다 정확하게 감지할 수 있습니다. 절차를 보여주는 것은 린지 레아, 내 실험실에서 연구 동료가 될 것입니다.
마취 된 성인 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 어깨 수준에서 마우스의 뒷면에 모피를 제거하기 위해 코달 - 로스트랄 운동에 전기 면도기 클리퍼를 사용합니다. 뒷면에서 20도 각도로 유지된 면도날을 로스트랄-소달 운동으로 사용하여 노출된 피부에서 남은 모발을 제거한 다음, 포비단 요오드 1개, 이소프로필 알코올 준비 패드 와이프 1개로 피부를 청소합니다. 상처 유도의 경우 깨끗한 종이 기반 수건을 치과 용 왁스로 덮인 평평한 표면에 드레이프하고 마우스를 수건에 놓습니다.
등대 중간선을 따라 견갑골 사이에 마우스의 피부를 꼬집어 몸에서 멀리 끼인 피부를 당깁니다. 마우스를 사이드 거짓말 위치로 전환하면 원하는 상처 크기의 생검 펀치를 가능한 한 신체에 가깝게 배치하고 피부가 이완할 수 있습니다. 흔들기 동작을 사용하여 펀치를 눌러 피부의 모든 층을 뚫고 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 상처에서 펀치 생검을 제거하여 필요에 따라 주변 피부에서 펀치를 풀어주세요.
그런 다음 마우스가 모니터링 및 진통제로 복구할 수 있도록 합니다. 상처 침대의 형태 분석의 경우 디지털 염색 된 상처 이미지를 엽니 다. 스케일 및 측정 기본 설정을 설정하려면 분석에서 스케일 설정을 선택하고 픽셀, 알려진 거리 및 길이 단위로 거리를 입력합니다.
전역 및 확인을 선택하여 열려 있는 각 이미지에 대해 배율을 동일하게 유지하고 측정 분석 및 설정을 선택하여 영역 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 상처 길이를 측정하려면 프리핸드를 선택하고, 상처한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭부터 다른 쪽의 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭에서 시작하여 진피 표피 접합을 따라 추적할 수 있는 도구를 사용합니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 이동 혀가 끝나는 상처의 한쪽에 진피 표피 접합을 따라 갈과 화조직과 딱지 사이의 접합을 계속하여 혀와 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭에 도달한다.
그런 다음 분석 및 측정을 클릭합니다. 측정 길이는 스케일에 설정된 것과 동일한 단위로 나타납니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 과립 조직의 우수한 양상 또는 과립 조직과 첫 번째 모낭에 딱지 사이의 접합에 따라 각 표피 선도 가장자리 사이의 거리를 측정합니다.
상처 부위를 측정하기 위해, 프리핸드 도구를 사용하여 상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 다른 쪽의 부상되지 않은 조직의 제1 모낭에서 시작하여 표피또는 과립 조직의 우수한 측면을 추적한다. 과립 조직으로 모낭을 따라 수직으로 추적계속. 반대 모낭과 지방 조직 또는 근육에 도달하면, 상처의 반대편에 과립 조직의 열등한 경계를 따라 영역을 닫기 위해 모낭을 따라 출발점에 합류.
상처가 완전히 상피되지 않은 경우, 표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 앞가장자리까지 추적하고 진피 표피 접합에 따라 시작점으로 돌아갑니다. 그림과 같이, 전체 상처 에 걸쳐 2D 측정을 복용할 때, 우리는 현장에서 일반적으로 사용되는 방법인 상처의 중간에 만 2D 분석을 통해 불가능한 파라미터를 계산할 수 있었습니다. 본 실험에서, 상처 부위의 2D 측정은 상처 부위의 전체 상처 또는 중간 부분 집합에 걸쳐 사용되고 평균화되었고 실험 그룹 또는 분석 방법 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.
그러나 계산된 상처 부피는 실험군 간에 상당히 달랐으며, 상처 치유 파라미터의 심층 적 조직학적 분석의 중요성을 입증하였다. 조직 학적 분석을 위해 일관되게 크기의 상처를 생성하고 엄격한 직렬 단면을 수행하는 것은 정확한 형태 측정 해석에 중요합니다. 얼룩이 없는 단면은 면역형광 또는 마슨의 삼색 염색을 위해 상처 치유의 다른 측면을 측정하는 데 사용할 수 있으며, 플래시 냉동 상처는 정량적 단백질 분석을 위해 morphometry와 함께 사용될 수 있습니다.
