이 방법은 세포 보호 경로, 산화 스트레스 및 상처 치유 반응 사이의 연관성에 대한 조직 수리 및 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 강력한 기술의 주요 장점은 상처에서 반응성 산소 종을 실시간으로 측정하여 조직 재생에 미치는 영향을 결정할 수 있다는 것입니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 제 실험실의 연구 조교인 제니퍼 권(Jennifer Kwong)이 될 것입니다.
글루코프터를 사용하여 8-12주 된 당뇨병 마우스의 혈당을 측정합니다. 그리고 첫 번째 동물에서 등갈 머리를 제거하기 위해 머리 트리머와 탈모 크림을 사용합니다. 알코올 물티슈를 두 번 사용하여 노출된 피부를 청소하고 동물만 노출되도록 합니다.
알코올이 건조되면, 잘 확립 된 절제 상처 치유 기술에 따라 판니큘러스 카노를 통해 확장 두, 10 밀리미터 전체 두께 상처를 만들기 위해 멸균 10 밀리미터 생검 펀치를 사용합니다. 0.5밀리미터 두께의 실리콘 시트를 10mm 원형 컷아웃으로 사용하여 상처를 열고 4/0 실크 봉합사로 정석을 고정하십시오. 그런 다음 마우스를 완전한 회복까지 모니터링하여 열 패드에 놓고 개별 케이지로 돌아가기 전에 종이 타월을 2 주 동안 추가 중첩 재료로 제공합니다.
다음 날, 각 동물의 상처 상단에 말도 안되는 작은 간섭 RNA 젤 또는 실험적인 작은 간섭 Keap1 젤을 적용하고 팔다리를 무료로 유지하면서 젤을 제자리에 유지하기 위해 투명 필름 드레싱으로 각 몸통을 감싸십시오. 실험 3일째에는 27게이지 바늘이 장착된 1mm 주사기를 새로 준비한 L-012 용액을 장착하고 주사기를 감싸 빛으로부터 용액을 보호합니다. 상처를 이미지하기 위해, 상처를 방해하지 않고 각 마우스에서 투명 필름 드레싱을 부드럽게 제거하고 생물 발광 이미징 시스템의 이미징 챔버에 마우스를 배치합니다.
이미징 시스템 유입 및 유도 챔버 산소 수준을 분당 1리터로 설정하고 베이스라인에서 생체 발광 및 밝은 필드에 의해 마우스를 이미지화합니다. 다음으로, 알코올 물티슈로 복부를 닦은 다음 알코올이 건조되면 200 그램 체중, IP 당 L-012 용액 5 밀리그램을 각 마우스에 주입하십시오. 어떤 왜곡이 상처 치유 궤적 및 데이터 해석에 영향을 미치기 때문에 등쪽 피부에 상처를 방해하지 않고 L-012 용액을 주입하는 것은 매우 중요합니다.
주사 전에 동물이 등대 에서 안전하게 있는지 확인하십시오. 주사 직후, 마우스를 이미징 챔버에 있는 각자의 위치에 다시 배치하고 60분 동안 4분마다 1분씩 동물을 이미지하여 반응성 산소 종의 수준을 결정하는 관심 영역으로 10mm 상처를 정의한다. 그런 다음 동물을 개별 케이지로 되돌리기 전에 완전히 회복 될 때까지 모니터링하여 열 패드에 마우스를 놓습니다.
확립된 절제상처 모델에 따라 양측 의 상처를 낸 지 3일 후, L-012 주입 전에 는 생물발광이 관찰되지 않는다. 인트라인틴톨렌 L-012 용액 주입에 이어 반응성 산소 종이 검출되는 상처 부위에서 생체 발광이 관찰됩니다. 60분 동안 4~5분마다 1분마다 생물발광을 기록하는 것은 시간이 지남에 따라 관심 영역의 생물발광 포화도를 나타내며, 최적의 이미징 시간은 약 50분에서 관찰된 완전한 L-012 포화에 도달하는 데 소요됩니다.
L-012 주입 전후의 각 상처 부위의 생물 발광은 소박간섭 RNA 처리 또는 Keap1 의 작은 간섭 RNA 처리 마우스로 처리된 그 때 광강도의 총 수를 영역별로 나누어 계산될 수 있다. H&E 염색에 의한 반응성 산소 종 수준의 측정의 정확성을 확인하기 위해 10일 상처 조직 섹션을 분석하면 작은 간섭 넌센스 처리 조직에 비해 작은 간섭 Keap1 처리 된 상처로 세포 침통이 감소되어 실험용 젤 처리 된 동물의 염증 형태가 감소되었음을 나타냅니다. 상처 조직 섹션의 단백질 대식세포 마커인 F4/80의 면역 반응성 분석은 작은 간섭 하는 말도 안되는 처리된 상처에 비해 작은 간섭 Keap1 처리된 상처에 있는 대식세포의 감소수를 나타내며, 이 방법의 유효성을 더욱 강조합니다.
이 절차를 시도할 때 L-012가 만료되지 않았는지 확인하고 빛으로부터 보호된 장소에서 용액을 저어야 합니다. 이 절차에 따라, 표적 프로브 및 면역 분석 기반 방법은 반응성 산소 종과 그들의 상관 관계의 세포 소세포 국소화를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다, 상처의 redux 통계에 영향을 미치는 내정간섭 및 기계장치의 급속한 평가를 가능하게 합니다.
