이 뮤린 외형 담관 오르가노이드 시스템은 전임상 담관증 모델에 대한 제한된 접근과 다능성 줄기 세포 및 간 유래 콜린고이티테 오르가노이드 모델의 한계를 해결할 수 있습니다. 우리의 모델은 성인 조직 특정, 감소주의자, 재현 가능, 시간과 비용 효율적인. 그것은 인간의 조직에 액세스 할 수없는 실험실에 특별한 도움이 될 것입니다.
우리의 기술은 조직 재생 및 세포 대 세포 상호 작용을 연구하기 위하여 외형 담관 cholangiocytes의 거의 무제한 수의 배양을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 의사 인 주야 시오타 (Junya Shiota)가 될 것입니다. 간 내 담관 격리의 경우 성인 마우스를 척추 위치에 놓고 중간선을 따라 복강을 엽니다.
횡격막에 휴식 간을 철회하고 부드럽게 간 힐룸 바로 아래 일반적인 담관을 공개하는 근위 십이지장 당기기 기 위해 hemostat을 사용합니다. 메스를 사용하여 외형 담관과 주변 조직을 분리하십시오. 집게와 일반적인 담관의 근위 끝을 잡고, 간에서 덕트의 근접 끝을 해부하기 전에 십이지장과 그 시점 바로 위에 덕트를 해부.
즉시 격리 된 외형 담관을 얼음에 차가운 세척 버퍼가 들어있는 유리 접시에 넣은 다음 주변 조직에서 담관을 청소하고 0.5 밀리미터 섹션으로 다진다. 모든 조직이 다진 경우, 37섭씨에서 20분 배양을 위해 500마이크로리터의 해리 버퍼를 포함하는 튜브로 섹션을 옮기십시오. 해리의 끝에서, 얼음 차가운 세포 배양 배지의 500 마이크로 리터로 버퍼를 중화하고 18 게이지 바늘을 통해 조직 현탁액을 20 번 세례한 다음 20 게이지 바늘을 통해 20 회.
그런 다음 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 생성된 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브로 필터링합니다. 담즙 오르간 배양을 설정하려면 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 얼음 감기, 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 두 번째 원심분리를 위해 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.
세척된 펠릿을 액화, 얼음 차가운 지하 매트릭스 120마이크로리터로 재차 중단하고 40마이크로리터의 세포를 37도의 3개의 우물 의 중심으로 한 다음, 약 15분 동안 37도의 섭씨 조직 배양 배양에 접시를 놓습니다. 지하 매트릭스가 고화되면 플레이트를 인큐베이터로 되돌리기 전에 각 양에 섭씨 37도의 마이크로리터 600개를 첨가합니다. 그 후 3일마다 파종 배지를 신선한 오르가노이드 배양 배지의 600 마이크로리터로 교체하여 오르가노이드 성장을 정기적으로 반전된 현미경으로 모니터링한다.
외형 담관 배양을 통과하기 위해, 각 우물의 오르가노이드를 400 마이크로리터의 얼음-차가운 PBS 10회로 피펫한 후 우물 내용을 개별 1.5 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 25 게이지 바늘을 통해 각 혼합물을 4번 통과하여 오르가노이드를 분리하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 그런 다음 다시 도금에 적합한 비율로 지하 매트릭스의 세포를 다시 일시 중단합니다.
장기 외형 담관 오르가노이드 저장을 위해, 지하 매트릭스 방울을 방해하지 않고 실온 PBS로 오르가노이드의 각 우물을 세척하고 각 우물에 얼음 차가운 냉동 매체의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 유기체를 부드럽게 다시 분리하고 혼합물을 개별 극저온 바이알로 옮긴 다음, 유기체를 증기 상에서 장기 저장하기 위해 질소 탱크로 전송하기 전에 48시간 동안 비아알을 영하 80도의 섭씨에서 놓습니다. 파라핀 포함을 위한 오르가노이드를 준비하려면 배지를 섭씨 4도의 500 마이크로리터로 교체하고 액화 된 지하 매트릭스를 포함하는 개별 1.5 밀리리터 튜브로 각 우물에서 서스펜션을 전송하십시오.
원심분리에 의해 오르가노이드를 수집하고 수정된 P1000 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티츠를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 얼음 추위, 4%의 파라포름알데히드를 오가노이드에 추가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 날 아침, 실온 PBS의 1 밀리리터로 고정을 교체하고 실온에서 5 분 인큐베이션을 하고 오르가노이드를 원심 분리로 세 번 세척하십시오.
마지막 세척 후, 실온에서 5 분 배양에 대한 30 %의 1 밀리리터에 오르가노이드를 다시 중단하고 실온에서 70 %의 에탄올의 1 밀리리터에서 5 분 인큐베이션이 있습니다. 70%에탄올 인큐베이션이 끝나면 원심분리로 오르가노이드를 수집하고 실온에서 5분 동안 1밀리리터1밀리리터로 오르가노이드를 재중단합니다. 100% 에탄올 인큐베이션의 끝에서, 20초 동안 또는 액화될 때까지 전자레인지에 젤을 가열하고, 각 오르가노이드 튜브에 액화 젤 50 마이크로리터를 추가합니다.
시편 처리 젤이 고화될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓고 파라핀 임베드더에서 추가 처리를 위해 카세트의 파란색 스폰지 패드 사이로 각 튜브에서 오르가노이드 방울을 전달합니다. 카세트를 단계당 15분 동안 프로그래밍된 티슈 프로세서에 넣은 다음 표준 프로토콜에 따라 면역 조직화학 염색 및 분석을 위해 섹션당 4마이크로미터로 시편 처리 젤에 파라핀 임베디드 오르가노이드를 섹션으로 배치합니다. 엑스트라간 담관 기관도금 효율은 신생아 또는 성인 마우스로부터 분리될 때 약 2%입니다.
2항 후, 성인 마우스에서 유래한 외형 담관 오르노이드의 도금 효율이 11%로 증가하여 안정적으로 유지됩니다. 오르가노이드의 대다수는 희귀 불규칙한 오르가노이드를 가진 모든 통로에 걸쳐 낭포성 형태를 보여줍니다. 오르가노이드는 5~7일 만에 성장 피크에 도달하여 장루 잔해를 축적하고 악화되기 시작합니다.
따라서 오르가노이드 배양의 유지를 위해 오르가노이드는 7~10일마다 분할되어야 한다. 면역 형광으로 분석할 때, 엑스트라간 담관 오르가노이드는 E-cadherin에 의해 표시된 상피 세포의 순수한 인구로 이루어져 있습니다. Organoid 세포는 또한 담즙 전구 세포의 마커뿐만 아니라 담즙 분화의 마커를 보여줍니다.
중요 한 것은, 오르가노이드 세포의 높은 백분율은 아세틸화 알파 Tubulin에 의해 표시 된 기본 실륨을 소유, 이는 정상적인 cholangiocytes의 특징이며 적절 한 오르가노이드 세포 편광을 제안. 설명된 온도 조건에 대한 닫기 준수가 요구된다. 세심한 담관 해부는 췌장 세포 오염을 방지합니다.
세포 물질의 손실은 원심 분리 후 주의 깊은 조작에 의해 피할 수 있습니다. 이 오르가노이드는 전임상 모델로 사용될 수 있습니다, 유전및 약리학적으로 조작, 또는 약물과 전염성 에이전트의 효과를 테스트하는 데 사용. 이 방법은 담랑고이트 생물학의 기전을 추가로 연구하기 위하여 유전자 변형된 마우스 모형을 이용하려는 실험실에서 이용될 수 있습니다.
