원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 (주)에 대한 CRC에 의해 투자 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 (CRC) 프로그램에 따라 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.

셀 준비 <ol><li> 인간 erythroleukemic K562 세포는 37 humidified 5 % CO 2 환경에서 10 % (V / V) 태아 소 혈청 20 MG / ML gentamicin과 보충 RPMI - 1640 배지 ° C.에 재배 </li><li> 이전 얼룩에 약 18시간 37 새로운 미디어 및 반환에 resuspend 호수 (PBS)를 버퍼 인산과 함께 기하 급수적으로 성장 세포 (5 × 10 5 세포 / ML에 최적) 씻어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 5 분 약 1,500 rpm으로 원심 분리하여 두 번 PBS로 세포를 씻어 신선한 미디어 resuspend. </li><li> 세포를 카운트하고 약 5 × 10 5 세포 / ML에 세포 밀도를 조정합니다. </li></ol> 전지는 자동화된 방법 (예 : Sysmex 또는 5-20 미크론 사이의 필터 크기 쿨터 카운터) 또는 trypan 파랑 제외 방법과 혈구계를 사용하여 어느 계산하실 수 있습니다. 세포의 수가 초과 (&gt; 800 세포 / cm 2) 비 균일한 얼룩이 발생할 수 있습니다. 조사 및 immunofluorescence 염색법 <ol><li> 적절한 라벨과 cytospin 클립, 필터 카드 및 슬라이드 조립. </li></ol> 조립하면 cytospin 장치 필터 카드에 구멍이 유입 경로와 일치하는지 확인. <ol start="2"><li> γ - 방사선 또는 X - 레이 (이 예제의 2Gy)로 세포를 노출. </li></ol> 조사 기간 동안 foci의 형성을 방지하기 위해, 이전과 조사 중에 5~10분 위해 얼음에 세포를 유지. 다음 조사는 37 세포를 품어 ° C, 5 %를 소요 시간 (최대 γH2AX 수준 30 분 1 시간,이 예제에서는 1 시간)에 대한 CO 2. <ol start="3"><li> 신선한 PBS에서 원심 분리하고 resuspend에 의해 감기에 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분 500 RPM 각 cytospin 퍼널 및 스핀에 세포 현탁액의 100-150 μL를 분배. </li><li> cytospins에서 슬라이드를 분리하고 전지가 적당히 약 15 분 동안 건조 공기 수 있습니다. </li></ol> 세포 형태는 분해 수 있으므로 세포가 완전히 건조시키지 마십시오. <ol start="6"><li> 소수성 펜으로 세포 주위에 원을 그립니다. </li><li> 실온 (RT)에서 5 분 4 % paraformaldehyde로 세포를 수정. </li></ol> 우리의 경험에서, paraformaldehyde로 고정이 에탄올이나 메탄올로 고정하는 우수합니다. 긴 고정 시간 (15-20분)가 자기편 세포의 최적의 고정에 필요한 반면, 서스펜션 전지는 RT에서 5 분 동안 고정이 필요합니다. 우리는 얼룩 즉시 일반적으로 높은 배경 형광 결과 -20 ° C에서 고정 슬라이드를 저장하는보다 더 나은 결과를 산출 찾으십시오. <ol start="8"><li> 오분 각 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.1 % 5 분 RT에서 트리톤 - X 100 세포 Permeabilize. </li></ol> 트윈 - 80에 비해 우리는 일반적으로 트라이 튼 - X 100 permeabilized 세포에서 더 나은 신호를 관찰합니다. 세포 종류에 따라 그것은 permeabilisation 시간을 변경해야 할 수 있습니다. 자기편 세포에서 15 분 permeabilization이 필요한 반면, 예를 들어, K562 세포에서 RT에서 5 분 permeabilization은 충분합니다. <ol start="10"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> RT 30 분 (3 * 10 분)에 대한 1 % BSA의 세포를 차단합니다. </li></ol> 우리는 혈청 (보조 항체와 동일한 종류에서 파생)와 PBS의 소 혈청 알부민을 사용하여 차단 효율성을 비교. BSA는 혈청에 비해 이차 항체가 아닌 특정 바인딩을 최소화에보다 효율적되었습니다. 우리는 하루 4 차단, 다른 차단 시간을 비교 ° C 3에 비해 X 십분 3 실온에서 X 이십분 차단 단계, 3 X 10 분 동안 차단하는 것이 최적이라고 판단. <ol start="12"><li> 각 슬라이드 : 기본 항체의 50 μL (500 1% BSA에 희석 1) 추가합니다. </li></ol> 감소 배경 얼룩 60 분 결과에 대한 RT에서 일차 항체와 배양 4에서 하룻밤 배양에 비해 ° C. <ol start="13"><li> 다른 마커를 얼룩이 동시에 종 (이 예제의 경우 예를 들어 마우스 방지 γH2AX와 토끼 안티 methylated H3K4)에 제기 항체를 사용합니다. </li><li> 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT 90 분 기본 항체와 부화. </li></ol> 모든 incubations은 humidified 얼룩의 여물 수행됩니다. <ol start="15"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL 추가 (1 : 1000 1 % BSA로 희석) 이차 항체를 각각의 슬라이드. </li></ol> 같은 슬라이드에 다른 마커에 대한 얼룩하기​​ 위해서는 D와 보조 항체를 사용하여ifferent 종의 특이성 (기본 항체에 따라)과 형광 방출 파장 (예 : 안티 - 마우스 알렉사 488 (녹색)이 예제에서 안티 - 토끼 알렉사 - 546 (적색)). <ol start="17"><li> 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT에서 60 분 세포를 품어. </li></ol> 이것은 페이딩 및 이차 항체의 건조 방지하기 어두운 습한 챔버에서 세포를 부화하는 것이 좋습니다. <ol start="18"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 각 슬라이드 (PBS에 희석 1:500) TOPRO - 3의 50 μL를 추가합니다. </li><li> 배 5 분 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드에서 초과 수분을 제거하고 방지 페이드 솔루션을 추가합니다. </li></ol> 그것은 완전히 방지 페이드 솔루션을 추가하기 전에 세포를 건조하지 않는 것이 좋습니다. <ol start="22"><li> Coverslip, 손톱 바니와 인감 및 실온에서 어둠 속에서 야간 슬라이드를 두십시오. </li></ol> 그것은 공촛점 특정 coverslips # 1.5 (0.16-19 미크론 두꺼운)와 투명 매니큐어를 사용하는 것이 좋습니다. 슬라이드에 coverslip을 배치하는 동안주의가 공기 거품의 형성을 피하기 위해 이동해야합니다. 이미지 수집 <ol><li> 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 현미경은 표준 GFP (녹색, 488 NM), PI (적색 543 NM)와 (블루 633 NM)까지 적색 레이저를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. </li></ol> 이미지 더 공간적 해상도를 공개 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. γH2AX foci의 크기가 0.5 μicrons보다 낮을 수 있기 때문에, 그것은 Z - 축을 따라 최소한 0.5 μicron 단계 크기의 이미지를 얻기위한 권장합니다. 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈 중 높거나 낮은 배율에 비해 선호합니다. 계산 foci를위한 이미징 많은 세포에 대한 그것은 스캔 8 속도와 1024 X 1024 픽셀의 이미지 크기를 사용하는 것이 바람직합니다. 그것이 2048 X 2048 픽셀의 이미지 크기와 함께 6 스캔 속도를 사용하는 것이 좋습니다 다른 핵 단백질 사이의 공간적 관계를 설명합니다. 여러 채널의 영상은 라인 스캔 인수는 프레임 스캔에 비해 좋습니다 때. 이것은 표백 방지하고 더 나은 해상도 이루어진다. 연속 스캔은 채널 사이를 통해 출혈을 방지하는 데 사용됩니다. Foci의 계산 이미지 분석 및 foci의 카운트는 다양한 소프트웨어 패키지를 (Metamorph, 이미지 - J와 Imaris를 inlcuding)를 사용하여 수행할 수 있습니다. Metamorph를 사용하여 foci의 계산에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. <ol><li> 직접 파일 메뉴에서 또는 빌드 번호 스택 옵션을 사용하여 오픈 γH2AX 이미지 스택. </li><li> 메뉴를 처리하는 이동하여 스택 연산을 선택했습니다. </li><li> 최대 투영을 선택하고 포함하는 비행기를 선택하고 확인을 누릅니다. </li><li> γH2AX 티파니로 결과 이​​미지를 저장합니다. 파일과 TOPRO - 3 (블루) 이미지를 엽니다. </li><li> 지역으로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주변 지역을 그립니다. </li><li> γH2AX TIFF 이미지를 클릭하고 프로세스 메뉴로 이동하여 형태학의 필터를 선택합니다. </li><li> 최상위 모자를 선택하고 원본 이미지로 γH2AX 이미지를 선택합니다. </li><li> 적용 최상위 햇 필터 및 결과 이​​미지는 foci 강도에 적은 소음 및 감소 변화와 바이너리 이미지 것입니다. </li></ol> 최상층의 가치를 선택할 때주의해야합니다. 최적의 값은 이전과 필터를 적용한 후에 이미지를 시각적으로 비교하여 얻을 수 있습니다. <ol start="9"><li> 프로세스 메뉴로 이동 및 임계값 이미지를 선택합니다. </li><li> 포함 임계값을 선택하고 아래와 높은 임계값 값을 선택합니다. </li></ol> 그것은 일반적으로 foci 번호에 영향을 문턱 값입니다. 임계값 값을 선택할 때 따라서, 많은 관심이 필요합니다. 이것은 최고의 γ - 방사선보다 낮은이 쥐 세포에 노출 서로 다른 임계값 값을 사용하여 계산 foci 번호로 달성하고 수동 계산 (눈으로)와 foci 번호를 비교할 수 있습니다. 최적의 임계값은 배경의 포함을 최소화하고 foci의 포함을 극대화 하나입니다. <ol start="11"><li> TOPRO - 3 이미지를 선택하고 지역 메뉴로 이동하여 전송 영역 옵션을 선택합니다. TOPRPO - 3으로 원본 이미지와 최상위 모자로 목적지를 선택하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 일단 핵 지역은 측정 메뉴로 이동하여 통합 Morphometry 분석을 선택 최상위 햇 이미지로 전송됩니다. </li><li> 지역으로 팝업 창을 선택 원본 이미지 톱 - 모자와 측정에. </li><li> 모든 영역을 측정 선택하고 최상층의 이미지에 해당 핵의 모든 foci 번호를 얻기 위해 측정을 클릭하십시오. </li><li> 각 지역에서 foci 번호는 로그 데이터 옵션을 사용하여 MS - Excel 파일에 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 3D이미지의 재건 Metamorph를 사용하여 스택에서 3D 이미지를 생성하려면 : <ol><li> 스택 메뉴로 이동 및 3D 재건을 선택합니다. </li><li> 회전 각도 (예 : 160 °, 320 °)를 선택합니다. </li><li> 3D 재건 유형 최대를 선택합니다. </li><li> 회전 비행기 (가로 또는 세로)을 선택할 수 있습니다. </li><li> Z - 보정 거리를 선택할 수 있습니다. </li></ol> 그것은 (최적 0.5 μicrons됩니다) Z - 거리 지정된 사용자를 사용하는 것이 바람직합니다. <ol start="6"><li> 3D 재건을 만드는 확인을 선택할 수 있습니다. </li></ol> 라인 스캔 분석 Metamorph를 사용하여 라인 스캔 분석 : <ol><li> 하나의 비행기 이미지 또는 스택 파일 중 하나를 엽니다. </li><li> 측정 도구 막대 명령으로 이동하여 라인 스캔 분석을 선택합니다. </li><li> 세포를 통해 선을 그릴이 자동으로 라인의 경로를 따라 각 마커의 형광 강도와 거리를 보여줄 것입니다. </li></ol> 다양한 염색질 마커의 공간적 관계를 명료하게하다하려면, 예를 들어, γH2AX foci와 히스톤 methylation, 그건이 마커의 밀도와 가난한 높은 지역에 걸쳐있는 라인을 그릴 것이 바람직합니다. 대표 데이터 이 예제의 목적을 위해 우리는 적극적으로 euchromatin을 속기의 epigenetic 결정자에게 DSBs의 공간적 분포를 평가하기 위해 γH2AX foci과 H3K4me하는 항체를 사용합니다. 마찬가지로 2Gy와 함께 조사에 따라 그림 1에 나타난 γH2AX foci 모두 H3K4me 얼룩과 TOPRO - 3 얼룩 DNA (밝은 스테인드 DNA 영역이 heterochromatin 나타내는 있습니다)에 대한 재미 있었다 지역에서 주로 형성했다. <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="그림 1" /> 이온화 방사선에 대한 응답으로 euchromatin에서 주로 그림 1. γH2AX foci 양식. 인간 erythroleukemic K562 세포에서 γH2AX foci (녹색)의 (A) Immunofluorescence 시각화 1 시간 γ - 방사선 후 (2 쥐). γH2AX foci가 적극적으로 euchromatin (적색)을 해독 대표, H3K4me 관련하여 표시됩니다. DNA는 TOPRO - 3 (파란색)과 함께 표시됩니다. 통합 이미지 (청색, 적색, 녹색)이 heterochromatic 지역에서 제외 γH2AX foci을 보여줍니다. 라인 스캔 분석 (형광 강도 대 거리)는 하나의 평면에있는 마커의 상대 분포를 나타냅니다. (B) 병합된 이미지의 3D 재구성 다른 비행기의 조각은 위에서 설명한.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)에 초기 분자 응답은 히스톤 H2AX 1,2의 터미널 SQEY의 모티브 내에서 빼앗아 - 139 잔기의 인산화입니다. H2AX 이러한 인산화은 phosphatidyl - inosito 3 키나제 (PI3K) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA - 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련 (ATR) 3 중재입니다. γH2AX이라고 H2AX의 phosphorylated 양식, immunofluorecence 현미경 3 쉽게 시각 아르 이산 foci를 형성 DSB의 사이트에서 염색질의 인접 지역으로 확산됩니다. γH2AX foci의 분석 및 quantitation 널리 특히 이온화 방사선에 대한 응답과 화합물 및 세포 독성 화합물 4를 수정 각종 방사선의 효능을 평가 DSB 형성 및 수리를 평가하는 데 사용되었습니다. DSBs이 드 노보 마커의 절묘한 특이성과 감도 감안할 때, 그것은 염색질의 맥락에서 DNA 손상과 복구의 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 예를 들어, 방사선 생물학의 중심 패러다임은 핵 DNA가 방사선 민감도와 관련하여 중요한 목표는 것입니다. 사실, 현장에서 일반적인 합의는 크게 DNA 손상 및 수리를위한 단일 템플릿으로 염색질을 볼 수있다. 그러나, DSBs의 분자 마커, euchromatin과 heterochromatin의 γ - 방사선 유발 γH2AX foci 형성의 차이로 γH2AX의 사용과 5-7 관찰되었습니다. 최근, 우리는 항체의 패널을 사용하거나 모노, 제정 heterochromatin 및 transcriptional 입을와 라이신 4 epigenetic 인쇄물 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 아르 디 또는 리신 9 트라이 - methylated 히스톤 H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), 단단히 이온화 방사선 8 다음 γH2AX의 공간적 분포를 조사하기 위해 적극적으로 euchromatic 지역을 해독하는 상호. 염색질 생물학에 관한 일반적인 아이디어에 따라, 우리의 연구 결과는 γH2AX 형성과 적극적인 전사 구 사이에 밀접한 상관 관계를 지적했다. 여기는 다른 epigenetic 마커, 이미지 분석 및 3D 모델링과 함께 공동 지방화에 특히 초점, 비 점착 성의 세포에 γH2AX foci의 감지 및 quantitation위한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K 조회수.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

비디오: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

연구

생물학

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

SCAP의 분석<em&gt; N</em&gt; 인간 세포의 -glycosylation 및 매매

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

정형 전압 (40-300 kV) X 선 시설을 사용하여 세포 조사를위한 Dosimetry

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

일차 및 불멸화 된 인간 각막 상피 세포에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 독성 결정

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...