새로운 나노 에멀젼 백신은 질병 전술 치료에 큰 이점이 있습니다. 이러한 세트 효과는 독특한 종양 절단, 특정 전술의 식별 및 낮은 전신 독성과 같은 특성에 의해 최소화됩니다. 우리는 이 프로토콜이 새로운 T 세포 이소형 펩타이드 점막 백신의 미래 개발을 위한 기술적, 이론적 단서를 제공할 것으로 기대합니다.
1 밀리그램의 모노 포스 포롤 지질 A와 100 마이크로 리터의 DMSO를 혼합하여 시작하십시오. 5분 동안 소용돌이치고 실온에서 4시간 동안 용해시킨다. TWEEN 80 및 I-OVA를 정량적으로 추가합니다.
성분을 혼합하고 스쿠알렌을 첨가하십시오. 다음으로, 제조 된 혼합물에 100 마이크로 리터의 MPLA 용액을 첨가한다. 나노 에멀젼 백신을 제조하기 위해 혼합 용액을 전체 부피의 약 70 %의 물방울에 넣고 부드럽게 저어 투명하고 쉽게 흐르는 혼합물을 얻습니다.
시험관 내 분석의 경우 BEAS2B 상피 세포를 되살리는 것부터 시작합니다. 수조를 켜고 온도를 섭씨 37도로 조절합니다. 냉동 세포 바이알을 섭씨 37도에서 템퍼링된 수조에서 빠르게 해동합니다.
해동 후, 세포를 15 밀리리터 멸균 원심분리 튜브에 신속하게 피펫팅하고, 2 밀리리터의 완전한 성장 배지를 첨가한다. 튜브를 129G에서 5분 동안 원심분리합니다. supinatant를 제거하고 완전한 성장 배지 2 밀리리터에서 세포를 재현탁하십시오.
세포를 다시 한번 원심분리한 후, supinatant를 제거하고 6밀리리터의 완전한 성장 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시킨다. 그런 다음 세포를 T25 배양 플라스크로 옮기고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포 밀도가 80%에서 90%에 도달하면 배양 배지를 버리고 2밀리리터의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
1 밀리리터의 0.25 % 트립 신을 첨가하여 1-2 분 동안 세포를 소화시킵니다. 세포의 반올림이 관찰되면 즉시 4 밀리리터의 완전한 성장 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 15 밀리리터 멸균 원심 분리기 튜브에서 샘플을 혼합하고 흡인합니다.
샘플을 129G에서 5분 동안 원심분리합니다. supinatant를 제거하고 세포를 RPMI 1640 완전 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 세포 계수를 위해 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 사용하고, 밀리리터 당 10 내지 5번째 세포로 세포를 1배로 희석한다.
이어서, BEAS2B 세포를 100 마이크로리터의 RPMI 1640 완전 배지 중의 96 웰 플레이트에서 웰 당 1배 내지 4배의 밀도로 플레이팅하고, 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 24시간 동안 예비인큐베이션한다. 인큐베이션의 끝에서, supinatant를 버리고, 100 마이크로리터의 RPMI 1640을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 대조군으로 BNE를 사용하여 다양한 최종 농도의 완전 성장 배지로 미리 희석된 I-OVA 나노 에멀젼, BNE와 혼합된 I-OVA 및 I-OVA를 각각 100마이크로리터씩 첨가하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.
배양이 완료되면 배지를 제거하고 플레이트를 어두운 곳으로 옮깁니다. 90 마이크로리터의 완전 성장 배지 및 10 마이크로리터의 CCK8 용액을 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 접시를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 배양합니다.
효소 표지 플레이트 리더를 사용하여 450 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 3일 동안 I-OVA, I-OVA plus BNE 및 I-OVA NE로 마우스의 비강 면역을 수행합니다. BNE 및 PBA를 실험 대조군으로 사용합니다.
그런 다음 가위로 약 3mm 두께의 비강 조직 샘플을 자르고 4% 파라포름알데히드에 넣습니다. 폐 조직을 제거하고 비강 및 전체 폐 조직을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정합니다. TEM 및 AFM은 나노 백신의 표면 제타 전위 및 입자 크기의 기본 특성을 평가하는 데 사용됩니다.
무신 안정성 분석에서 I-OVA NE의 입자 크기, 다분산 지수, 제타 전위 및 전기영동 이동도가 표시됩니다. BEAS2B 세포의 상대적 생존율은 24시간 동안 I-OVA, BNE+I-OVA 및 I-OVA NE의 다양한 펩타이드 농도에 노출된 배양에서 80% 이상입니다. I-OVA EN 그룹은 명백한 점막 독성, 조직 손상, 출혈 또는 염증 세포 침윤이 없었습니다.
상피 BEAS2B 세포는 수용액보다 더 많은 FITC 표지 I-OVA NE를 포획했습니다. 시험관 내에서 I-OVA NE의 서방 효과를 IV-IS 시스템을 이용하여 분석하였다. I-OVA NE 백신은 I-OVA의 수용액에 비해 서방성 효과가 있었다.
I-OVA NE 군에서는 생존율이 다른 군에 비해 높았고 종양 부피가 현저히 작아 다른 군보다 예방 보호 효과가 우수함을 시사한다. 치료 모델에서, 평균 생존 기간은 상이한 그룹들 사이에서 유의하게 달랐다. I-OVA NE 군의 종양 부피는 I-OVA 군보다 현저히 작았다.
이 절차에서는 혼합물을 고르게 저어주는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 나노 백신의 효율성이 떨어집니다.
