초고구조 분석 및 항체 염색을 위한 Planarian 난소 절제

이 방법의 목표는 TEM 또는 항체 염색을 사용하여 난모세포 생물학의 세포 및 세포 내 분석을 위해 플라나리아 Schmidtea mediterranea의 난소를 절개하는 것입니다. 이 프로토콜은 평면 난소의 국소화 및 절개를 용이하게 하기 위해 간단한 고정 단계를 사용하며, 이는 이전에는 접근할 수 없었던 이미징 깊이와 품질을 제공합니다. 이전에 이 기술을 한 번도 수행해 본 적이 없는 사람에게 가장 큰 어려움은 고정 후 난소를 국소화하는 것입니다.

실험 전에 성적 플라나리아의 해부학적 구조에 익숙해지는 것이 도움이 될 것입니다. 성적 성숙을 달성하기 위해 일주일에 두 번 유기농 간 페이스트를 성적 플라나리아에게 먹이어 실험을 준비하십시오. 성적으로 성숙한 벌레를 5%N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 실온의 접시에 담아 5분 동안 처리합니다.

NAC를 갓 준비한 4% 파라포름알데히드 10mL로 교체하고 가끔 흔들어 실온에서 1시간 동안 웜을 고정합니다. 벌레가 고정될 때 4%파라포름알데히드를 추가한 후 10분 후에 해부를 시작합니다. 상피 색소 침착을 관찰하여 복부 신경 삭을 찾습니다.이 척삭은 전방 두부 신경절에서 꼬리쪽으로 더 가벼운 색소 침착으로 두 줄로 나타납니다.

색소 침착을 관찰하여 추정되는 난소를 찾고 그 위치를 확인합니다. 두 개의 수술용 칼을 사용하여 난소 뒤쪽과 뒤쪽을 절개하여 앞쪽과 뒤쪽 벌레 조각을 완전히 제거합니다. 한 칼을 사용하여 웜을 고정하고 다른 칼을 사용하여 해부합니다.

절단에 사용된 칼을 청소하십시오. 두 개의 난소를 분리하려면 난소 조각의 중간 선을 자른 다음 복부 쪽을 아래로 뒤집습니다. 두 쌍의 5-SA 뾰족한 핀셋을 사용하여 등 조직을 벗겨내고 장을 노출시킵니다.

핀셋 끝이나 부드러운 브러시로 복부 조직 위에 있는 장 가지를 부드럽게 제거하여 난소를 노출시킵니다. 난소를 꺼내기 위해 주변 조직을 제거합니다. 난소를 꺼내 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨 1 밀리리터의 PBS로 세척합니다.

등쪽 및 복부 색소 침착 패턴을 사용하여 난소의 위치를 찾았습니다. 과도한 조직은 단계적으로 제거되었습니다. 난소가 드러나면 주변 조직을 잘라냈습니다.

여러 체세포 유형을 포함하는 난소는 초구조 분석과 면역형광 염색 모두에 사용되었습니다. 절개된 난소는 난모세포의 세포 및 세포 내 해부학적 구조에 대한 고품질 이미징을 가능하게 합니다. 이 절차를 통해 RNA 간섭 실험을 통해 난모세포 생물학의 분자 조절을 검사할 수 있습니다.

이 기술은 편형충 난모세포에서 핵 외피가 온전한 상태로 유지되는 대신 핵 단백질을 캡슐화하는 소포로 분해되는 새로운 현상(일명 폐쇄 유사분열) 또는 조각으로 분열(일명 개방 유사분열)을 발견하게 했습니다.