오늘 우리가 제시하는 기술은 내재적 신경 요인과 주변 성상 세포의 영향으로 인한 척수 뉴런 활동의 분석을 허용합니다. 이 기술은 척수에 특정한 인간 뉴런과 인간 성상 세포를 모두 안정적으로 생성하고 재현성을 위해 확장 할 수있는 기능적 출력 측정을 사용합니다. 우리가 제시하는 기술은 산발적 또는 유전 질환 환자의 뉴런을 사용하여 근 위축성 측삭 경화증과 같은 척수 뉴런 특정 질병을 조사 할 수있게합니다.
우선, 콜로니의 중앙에 흩어져있는 흰색 영역이 표시되도록 충분히 조밀 한 콜로니에 대한 인간 iPSC 플레이트를 검사하십시오. 그런 다음 셀 포장을 시작하려면 마커로 플레이트의 하단 외부 표면에 격자 선을 그려 전체 플레이트를 정확하게 덮을 수 있습니다. 배양 후드에서 10배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁으로 수동으로 긁어 분화된 콜로니를 분리합니다.
다음으로 플레이트를 PBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 예열 된 5 밀리리터의 조직 해리 프로테아제를 첨가하십시오. 플레이트에서 콜로니를 들어 올리기 전에 콜로니의 가장자리가 둥글게 시작될 때까지 섭씨 37도에서 4-7 분 동안 세포를 배양합니다.
해리 프로테아제를 조심스럽게 흡인하고 콜로니를 제거하지 않고 PBS로 플레이트를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 5 밀리리터의 사전 예열 된 인간 iPSC 배지를 배양 플레이트에 첨가하십시오. 그런 다음 위에서 아래로 앞뒤로 움직여 5 밀리리터 피펫 끝으로 전체 플레이트를 긁고 콜로니를 들어 올리면서 더 작은 세포 응집체로 분해합니다.
인간 iPSC를 신경 전구 세포로 분화합니다. 인간 iPSC가 단층을 형성하고 90% 합류하면 원고에 설명된 대로 분화를 시작합니다. 12일째, 트립신 처리 후, 세포가 현탁 상태에 있지 않은 경우, 1000 마이크로리터 피펫 팁에서 신경 유도 배지를 세포 전체에 원을 그리며 분출하여 전체 표면을 덮음으로써 기계적으로 세포를 분리합니다.
신경 전구 세포 배양 물이 동결되면 해동하십시오. 원고에 기재된 배지 교환 및 PBS 헹굼 후, 배지를 0.02 마이크로몰 시토신 아라비노사이드를 함유하는 운동 뉴런 분화 배지로 변경한 다음, 신경교세포 커밋 전구세포가 유사분열 후 운동 뉴런 전구체 하에서 단일 증식 편평한 세포로 나타날 때 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 48시간 동안 세포를 배양하고, 셀 클러스터에서 집계됩니다. 나중에 원고에 표시된대로 중간 교환을 수행했습니다.
도금 당일 또는 그 전, 먼저 PLO를 물 또는 PBS에 희석하여 24웰 MEA 플레이트의 코팅을 시작합니다. 그런 다음 각 웰에 15-20 마이크로 리터의 PLO를 추가하여 웰 중앙에 액적을 형성하고 전극 영역을 덮어 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록합니다. 우물 주변의 구획에 물을 추가하여 충분한 습도를 확보하십시오.
그리고 PLO를 섭씨 37도에서 1 내지 2시간 동안 배양한다. 그런 다음 플라스틱 마이크로 피펫 팁을 사용하여 전극을 만지지 않고 가능한 한 많은 PLO를 흡인합니다. 다음으로 250 마이크로 리터의 물로 우물을 세 번 씻으십시오.
피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하고 뚜껑을 제거한 상태에서 표면을 건조시킵니다. 다음으로, 15 내지 20 마이크로리터의 희석된 라미닌을 첨가하여 각각의 전극 어레이를 덮는다. 습도 구획에 물을 추가하고 뚜껑을 교체 한 후 섭씨 37도에서 최소 2 시간에서 밤새 배양하십시오.
도말 당일, 운동뉴런과 성상세포 배양액을 PBS로 한 번 헹군 후 0.05%트립신을 첨가하고 섭씨 37도에서 약 5분간 배양하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 억제제가 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브에 세포를 모으십시오. 그리고 모든 세포가 수집되도록 매체 또는 베이스로 플레이트를 세척합니다.
중심화에 의해 세포를 펠릿 다운합니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 피펫을 사용하여 20마이크로몰의 ROCK 억제제가 포함된 공동 배양 배지로 운동 뉴런과 성상세포를 재현탁하여 1밀리리터의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 혈구계를 사용하여 운동 뉴런과 성상 세포를 세십시오.
그리고 세는 동안, 세포 현탁액을 유지하고 섭씨 4도의 스티로폼 랙에 넣었다. 두 세포 현탁액 1 밀리리터를 300 배 G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 원하는 부피를 계산하고 펠릿을 다시 현탁하십시오.
필요한 양의 뉴런과 성상 세포 현탁액을 같은 비율로 결합하고 피펫팅으로 부드럽게 두 번 혼합하여 완전히 결합합니다. 그런 다음 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거하고 10 마이크로 리터의 최종 결합 셀 현탁액을 각 웰로 옮겨 전극 어레이를 덮는 작은 액적을 형성합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 방해받지 않은 세포 방울과 함께 20 내지 30분 동안 배양하여 플레이트 상에 초기 부착물을 형성한다.
이어서 ROCK 억제제를 함유하는 250 마이크로리터의 따뜻한 공동 배양 배지를 각 웰의 벽에 내려놓고 각 웰의 반대쪽 벽에 동일한 부피를 피펫팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 24 내지 36시간 동안 인큐베이션한다. 다음날, 판에 파편이나 죽은 세포가 있는지 검사하십시오. 필요한 경우, 배지를 ROCK 억제제를 함유하는 새로운 공동 배양 배지로 교환한다.
그렇지 않으면 공동 배양 둘째 날부터 ROCK 억제제가 없는 공동 배양 배지를 사용하여 일주일에 두 번 반배지 교환을 수행합니다. 녹음을 수행하려면 공동 배양 첫날 온도를 섭씨 37도, 이산화탄소를 5%로 설정하여 가능한 한 빨리 시작한 다음 플레이트를 녹음기로 옮기고 녹음하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이룹니다. 실험 설계에 따라 격일로 또는 매주 1-15분에 걸쳐 기준 활동을 기록합니다.
뉴런이나 성상 세포를 표적으로 하는 화합물의 일시적인 전기생리학적 효과를 조사하려면 플레이트 뚜껑을 제거하되 기계 뚜껑을 닫은 상태로 유지하고 최소 1분 동안 기준 활동을 기록하십시오. 전기 생리 학적 기록을 중단하지 않고 수동으로 기계 뚜껑을 열고 25 마이크로 리터의 배지를 적절한 약물 운반체와 교환하십시오. 그런 다음 수동으로 뚜껑을 닫고 필요한 경우 추가 분 동안 녹음하십시오.
마찬가지로 관심있는 약물을 테스트하십시오. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대되었습니다. 신경 발생은 BMP 및 TGF- 베타 경로를 비활성화함으로써 이중 SMAD 억제를 통해 시작되었습니다.
그 결과 신경 상피 줄기 세포가 분열되어 다층 상피가 생성되었다. 신경 성장 인자와 신경신성 섬모 신경영양 인자에 대한 조기 노출은 전구 세포의 혼합 집단을 생성했습니다. 뉴런은이 혼합 된 집단에서 자발적으로 나타났습니다.
교신성 스위치는 JAK-STAT 경로의 활성화를 통해 성상세포 분화를 유도했습니다. 노치 억제제 처리 및 분화된 운동 뉴런 세포의 척수 동일성은 높은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 발현 수준에 의해 뒷받침되었습니다. 시험관 내 배양 후 90일째에 인간 iPSC 성상교세포는 S100 베타 및 GFAP 발현으로 표시된 성숙한 표현형을 나타냈으며, 척수 영역 정체성은 이전에 매의 발현에 의해 뒷받침되었습니다.
공동 배양 된 세포는 성상 세포와 함께 자발적으로 재배열되어 하단에 공급 층을 생성하고 상단에 네트워크를 연결하는 뉴런을 만듭니다. 뉴런은 단독으로 배양할 때 큰 세포 클러스터로 응집되는 반면, 인간 iPSC 운동 뉴런과 인간 iPSC 성상세포의 공동 배양은 단층이 고르게 분포된 결과를 낳았습니다. 인간 iPSC 성상 세포는 공동 배양에서 더 높은 수준의 스파이크 및 파열 활동으로 나타난 바와 같이 인간 iPSC 운동 뉴런의 전기 생리 학적 성숙을 향상 시켰습니다.
우리의 경험에 따르면 줄기 세포 배양과 초기 NPC 분화는 기술적 오류에 가장 어렵고 민감합니다. 이 단계에서는 문제 해결을 위한 여유가 거의 없이 일관되고 정확하게 기술을 수행해서는 안 됩니다. 여기에 설명된 공동배양 기술은 다른 세포 유형 특이적 모델에서도 사용될 수 있습니다.
